Recent Articles

/em /por

From Angewandte Chemie International Edition

Total Synthesis of C30 Botryococcene and epi‐Botryococcene by a Diastereoselective Ring Opening of Alkenylcyclopropanes

anie201808709-fig-5001-m

Synthesis, Structural Reassignment, and Antibacterial Evaluation of 2,18‐Seco‐Lankacidinol B

anie201808612-fig-0001-m

Editorial – Empowering Students to Innovate: Engagement in Organic Chemistry Teaching

I recently had the pleasure of competing for the Robert Foster Cherry Award for Great Teaching given biennially by Baylor University. In preparing for the competition, I spent considerable time reflecting on my own past experiences as a student, as well as the key philosophies that have helped to transform organic chemistry—often dreaded by students—into one of the most popular classes on the UCLA campus. In this Guest Editorial, I focus on just one key aspect, which involves capturing the extraordinary potential of our students to innovate.

As a “pre‐med” student at NYU, I took chemistry courses out of necessity. “OChem” in particular was reputed to be an intense weed‐out class that required exhaustive memorization and regurgitation of information. On our first day of class in 1997, Professor Yorke Rhodes convinced us otherwise. He told tales of the great contemporary organic chemists who were educated at NYU, such as Professors Eric Jacobsen and Al Myers, along with recent graduate Phil Baran, who was already a rising star in graduate school at the time.

(read more…)

Enantioselective Total Synthesis of (+)‐Plumisclerin A

anie201808517-fig-0001-m

Total Synthesis of Epicolactone

anie201807709-fig-5001-m

From Natural Product Reports

Hot off the Press

A personal selection of 32 recent papers is presented covering various aspects of current developments in bioorganic chemistry and novel natural products such as huperphlegmine A from Huperzia phlegmaria.

Graphical abstract: Hot off the Press

From the Journal of Natural Products

Medermycin-Type Naphthoquinones from the Marine-Derived Streptomyces sp. XMA39

np-2018-00544u_0007

From ACS Medicinal Chemistry Letters

Marine Natural Products in Medicinal Chemistry

ml-2018-003689_0001

Recent Articles

/em /por

Toward Understanding the Chemistry and Biology of 1-Deoxy-d-xylulose 5-Phosphate (DXP) Synthase: A Unique Antimicrobial Target at the Heart of Bacterial Metabolism

ar-2018-00321z_0008

 

Synthetic Lava Brings Eruption into the Lab

oc-2018-006155_0001

Molecular Basis for Olefin Rearrangement in the Gephyronic Acid Polyketide Synthase

cb-2018-00645k_0004

 

Biochemical and Structural Characterization of TtnD, a Prenylated FMN-Dependent Decarboxylase from the Tautomycetin Biosynthetic Pathway

cb-2018-00673z_0006

Unexpected Bacterial Origin of the Antibiotic Icosalide: Two-Tailed Depsipeptide Assembly in Multifarious Burkholderia Symbionts

cb-2018-006004_0005

Chemistry and Properties of Indolocarbazoles

cr-2018-001865_0130

Open Access With A Vengeance

Derek Lowe – Here’s something to keep an eye on: eleven of the largest national research funding agencies in Europe have announced a plan to require open-access publication of papers arising from their grants. The plan is that by 2020, all such work must be published in compliant open-access journals or on compliant open-access platforms. (read more…)

Sulfonic Acid-Containing Flavonoids from the Roots of Phyllanthus acidus

np-2018-003225_0004 (1)

Calothrixamides A and B from the Cultured Cyanobacterium Calothrix sp. UIC 10520

The first author of this paper is Camila M. Crnkovic, a Brazilian student who obtained a PhD degree at the School of Pharmacy, University of Illinois, Chicago, under the supervision of Jimmy Orjala.

np-2018-004324_0002

GEX1A, a Polyketide from Streptomyces chromofuscus, Corrects the Cellular Defects Associated with Niemann-Pick Type C1 in Human Fibroblasts

np-2018-00314x_0005

Peloruside E (22-Norpeloruside A), a Pelorusane Macrolide from the New Zealand Marine Sponge Mycale hentscheli, Retains Microtubule-Stabilizing Properties

np-2018-005577_0003

Colocynthenins A–D, Ring-A seco-Cucurbitane Triterpenoids from the Fruits of Citrullus colocynthis

np-2018-00461s_0004

Hexaricins, Pradimicin-like Polyketides from a Marine Sediment-Derived Streptosporangium sp. and Their Antioxidant Effects

np-2018-003972_0003

Investigation of the Biosynthesis of the Lasso Peptide Chaxapeptin Using an E. coli-Based Production System

np-2018-00392g_0004

Diaporindenes A–D: Four Unusual 2,3-Dihydro-1H-indene Analogues with Anti-inflammatory Activities from the Mangrove Endophytic Fungus Diaporthe sp. SYSU-HQ3

jo-2018-01738q_0011

Divergent Diels–Alder Reactions in the Biosynthesis and Synthesis of Endiandric-Type Tetracycles: A Computational Study

jo-2018-01594c_0006

Target Identification of Yaku’amide B and Its Two Distinct Activities against Mitochondrial FoF1-ATP Synthase

ja-2018-07339c_0009

C–H Hydroxylation in Paralytic Shellfish Toxin Biosynthesis

ja-2018-08901h_0007 (1)

Divergent Entry to Gelsedine-Type Alkaloids: Total Syntheses of (−)-Gelsedilam, (−)-Gelsenicine, (−)-Gelsedine, and (−)-Gelsemoxonine

ja-2018-081272_0006

Sodorifen Biosynthesis in the Rhizobacterium Serratia plymuthica Involves Methylation and Cyclization of MEP-Derived Farnesyl Pyrophosphate by a SAM-Dependent C-Methyltransferase

ja-2018-08510r_0008

Metabolic and Biosynthetic Diversity in Marine Myxobacteria

Substrate-assisted enzymatic formation of lysinoalanine in duramycin

41589_2018_122_Fig1_HTML

Biosynthesis and chemical diversity of β-lactone natural products

Graphical abstract: Biosynthesis and chemical diversity of β-lactone natural products

The architectures of iterative type I PKS and FAS

Graphical abstract: The architectures of iterative type I PKS and FAS

Pyridoxal phosphate-dependent reactions in the biosynthesis of natural products

Graphical abstract: Pyridoxal phosphate-dependent reactions in the biosynthesis of natural products

Unusual subunits are directly involved in binding substrates for natural rubber biosynthesis in multiple plant species

1-s2.0-S003194221830476X-egi10HLK8K92PS

Recent Articles

/em /por

Reconstitution of Enzymatic Carbon–Sulfur Bond Formation Reveals Detoxification-Like Strategy in Fungal Toxin Biosynthesis

cb-2018-00413f_0005

Mycobacterial MenJ: An Oxidoreductase Involved in Menaquinone Biosynthesis

cb-2018-004027_0008

Estudo traz novas pistas sobre sofisticada sociedade que ergueu enigmáticas estátuas gigantes da Ilha de Páscoa – A maior parte dos quase 900 moais mede de 4 a 6 metros de altura

Céticos do clima devem pedido de desculpas a quem acreditou neles

Abyssomicin Monomers and Dimers from the Marine-Derived Streptomyces koyangensis SCSIO 5802

np-2018-00448j_0008

Review of Natural Product Biosynthesis: Chemical Logic and Enzymatic Machinery

51sPWkiemfL._SX331_BO1,204,203,200_

Staurosporine Derivatives Generated by Pathway Engineering in a Heterologous Host and Their Cytotoxic Selectivity

np-2018-00103h_0005

Complete Genome of Micromonospora sp. Strain B006 Reveals Biosynthetic Potential of a Lake Michigan Actinomycete

np-2018-00394t_0008

Catenulobactins A and B, Heterocyclic Peptides from Culturing Catenuloplanes sp. with a Mycolic Acid-Containing Bacterium

np-2018-00261n_0005

Ansamycins with Antiproliferative and Antineuroinflammatory Activity from Moss-Soil-Derived Streptomyces cacaoi subsp. asoensis H2S5

np-2018-00203m_0007

Terpeno produzido por actinobactéria entra na composição de perfumes

/em /por

Reportagem publicada no jornal Folha de São Paulo comenta sobre o “odor da chuva” e alguns de seus principais componentes, que já estão sendo utilizados na composição de perfumes, como a geosmina, produzida por uma actinobactéria.

Por que o cheiro da chuva é tão bom? – Bactérias, plantas e até trovoadas têm influência no aroma de ar limpo

Não é só alívio, após um longo período de seca, que faz com que o cheiro da chuva seja tão bom. Há também a química envolvida.

Bactérias, plantas e até trovoadas têm influência no aroma de ar limpo e terra molhada que a gente sente após uma tempestade. Conhecido como “petrichor”, esse odor tem sido estudado por cientistas e até por fabricantes de perfume.

TERRA MOLHADA

O nome “petrichor” foi cunhado por dois pesquisadores australianos em 1960. A palavra vem do grego “petros”, que significa “pedra”, e do termo “ichor”, que quer dizer “o fluido que passa pelas veias dos deuses”.

Essa fragrância que a gente sente quanto a chuva bate no solo é produzida por uma bactéria. “Micróbios são abundantes no solo”, explica o professor Mark Buttner, diretor do departamento de microbiologia do John Innes Centre, na Inglaterra.

“Quando você diz que sente cheiro de terra molhada, na verdade está sentindo o cheiro de uma molécula sendo criada por um certo tipo de bactéria”, disse ele à BBC News.

Essa molécula é o “geosmin” (1), produzido pela bactéria Streptomyces. Presente na maioria dos solos saudáveis, essa bactéria também é usada para produzir alguns tipos de antibióticos.

Quando as gotas de água caem na terra, fazem com que o geosmin (1) seja lançado no ar, tornando-o bem mais abundante do que antes da chuva. “Vários animais são sensíveis a esse cheiro, mas os seres humanos são extremamente sensíveis a ele”, diz Buttner.

ar-2011-00198d_0008

Os pesquisadores Isabem Bear e RG Thomas, que deram o nome de “petrichor” ao cheiro da chuva, descobriram que na década de 1960 ele já era “capturado” para ser vendido como uma essência chamada “matti ka attar”, em Uttar Pradesh, na Índia.

Agora, o geosmin está se tornando mais comum como ingrediente de perfume. “É uma substância potente. Há algo de bem primitivo nesse cheiro”, afirma a perfumista Marina Barcenilla. “Mesmo quando você o dilui, ainda é possível identificá-lo”, acrescenta.

Mas nós temos uma relação contraditória com o geosmin –ao mesmo tempo em que somos atraídos pelo aroma dele, muitos de nós tem aversão pelo gosto.

Embora não seja tóxico para seres humanos, pequenas quantidades podem fazer com que rejeitemos um copo de água ou de vinho que tenha sido “contaminado” pela substância. “Não sabemos por que não gostamos de geosmin. Por algum motivo, associamos a algo ruim”, diz o professor Jeppe Lund Nielson, da Universidade de Aalborg, na Dinamarca.

PLANTAS

De acordo com Nielson, pesquisas sugerem que o geosmin pode estar relacionado ao “terpeno” –fonte do perfume de várias plantas. E a chuva pode acentuar essas fragrâncias, diz o professor Philip Stevenson, pesquisador-chefe do Royal Botanic Gardens, em Londres.

“Normalmente, as químicas das plantas que têm cheiro bom são produzidas pelos ‘cabelos’ das folhas. As chuvas podem danificar as folhas e, com isso, soltar os componentes dela”, explica.

“A chuva também pode romper materiais secos das plantas, liberando substâncias químicas de forma similar a quando quebramos e esmagamos ervas. Com isso, o cheiro fica mais forte.”

Períodos de seca também podem reduzir o metabolismo das plantas. O retorno das chuvas pode desencadear uma aceleração, fazendo com que as plantas exalem um cheiro agradável.

RAIOS
As trovoadas também desempenham um papel relevante, ao criar um aroma de ozônio acentuado e limpo, em decorrência das descargas elétricas na atmosfera.

“Além dos raios, as trovoadas e chuvas ajudam a melhorar a qualidade do ar. A poeira, o aerossol e outras partículas são varridas pela chuva e pelos raios, limpando o ar”, explica a professora Maribeth Stolzenburg da Universidade do Mississippi, nos EUA.

Conheçam mais sobre a biossíntese da geosmina, e outros terpenos de bactérias, em artigo de David E. Cane e Haruo Ikeda, publicado em 2012 na revista Accounts of Chemical Research.

Remarkable alkaloids from Aspergillus versicolor and Ervatamia divaricata

/em /por

Two recent papers published in The Journal of Organic Chemistry report alkaloids isolated from a fungus culture and from the roots of the tree Ervatamia divaricata.

The first paper comes from the groups of Professors Xue, Zhu and Zhang of Huazhong University of Science and Technology. It reports the isolation of 8 new alkaloids from cultures of Aspergillus versicolor. An unusual feature observed for the congeners is the cyclization of a prenyl group, leading to a pyrano[3,2-f ]indole, a rather rare feature observed for prenylated alkaloids. The structures of four of the eight new compounds have been established by X-ray diffraction analysis. The remaining four analogues by NMR and MS analyses. Stereochemical assignments were performed by analysis of NOESY and electronic circular dichroism data. The absolute stereochemical proposition for compound 6 was based on experimental and theoretical [∝]D measurements. Robust spectroscopic data supported the structural assignments.

The alkaloids were tested as inhibitors of nitric oxid production induced by lipopolisaccharide. Compound 7, the most active one, was almost 50 times less active than the control. Structure identification came as the strongest feature of the paper. These alkaloids belong to the class of prenyl-indole alkaloids, whose biosynthesis has been unveiled mainly by David H. Sherman group at the University of Michigan.

Presentation2

O segundo, do grupo do Prof. Zhang da Jinan University e do grupo dos Profs. Ye e Zhang da Universidade de Macau, reporta as estruturas de dois alcaloides indólicos monoterpenoídicos triméricos. As ervadivaminas A e B foram obtidas a partir de 51,5 kg de raízes de Ervatamia divaricata. Foram isolados 6,0 e 5,0 mg dos alcaloides, em rendimento de aproximadamente 0,0001%. As estruturas dos composto 1 e 2, incluindo configuração absoluta, foram estabelecidas por difração de raios-X e análises de RMN e espectrometria de massas. O alcaloide 1 apresentou atividade citotóxica moderada contra linhagens de células tumorais A-549, MCF-7, HT-29, e HepG2/ADM. Já o alcaloide 2 foi inativo. Novamente, o ponto forte do artigo é o isolamento e determinação estrutural de alcaloides complexos o suficiente para dar muita dor de cabeça a químicos orgânicos sintéticos. Todavia, a ciência do artigo é considerada irrelevante e pouco inovadora.

Presentation1

É urgentemente necessário avisar o editor do Journal of Organic Chemistry que a revista está aceitando para publicação artigos de ciência irrelevante e pouco inovadora.

Refs

Huaqiang Li, Weiguang Sun, Mengyi Deng, Qun Zhou, Jianping Wang, Junjun Liu , Chunmei Chen, Changxing Qi, Zengwei Luo, Yongbo Xue, Hucheng Zhu, and Yonghui Zhang. Asperversiamides, Linearly Fused Prenylated Indole Alkaloids from the Marine-Derived Fungus Aspergillus versicolor. J. Org. Chem., DOI: 10.1021/acs.joc.8b01087.

Zhi-Wen Liu, Jian Zhang, Song-Tao Li, Ming-Qun Liu, Xiao-Jun Huang, Yun-Lin Ao, Chun-Lin Fan, Dong-Mei Zhang, Qing-Wen Zhang, Wen-Cai Ye, and Xiao-Qi Zhang. Ervadivamines A and B, Two Unusual Trimeric Monoterpenoid Indole Alkaloids from Ervatamia divaricata. J. Org. Chem., DOI: 10.1021/acs.joc.8b01371.

Purificação e isolamento

/em /por

“As structure determination of molecules becomes increasingly routine, the role played by isolation becomes increasingly important. Modern spectroscopic methods have made it feasible to deal with minute quantities of material or very unstable compounds and, in many cases, such compounds are essential in daily maintenance of life. However, no structural studies can be carried out unless the factor is isolated in a pure state. Isolation and purification of bioactive factors are thus the first obstacles to be overcome; it frequently is the dividing point between successful or unsuccessful studies of further structured-based investigations on mode of action, and so on.” (Bruening et al., J. Nat. Prod., 1986, 49, 193-204).

“In any study in the area of natural products chemistry, isolation and purification are the mandatory first steps that one encounters and must accomplish. Unfortunately, however, this phase is often handled too casually and without the realization that success or failure of a project is often solely determined by this step.”(…) “Structure determination has nowadays become quite routine, but isolation and purification steps will never be routine.” (Nakanishi, K., in Natural Products of Woody Plants (J. W. Rowe, editor), Springer-Verlag, Berlin, 1989).

Idealmente o processo de isolamento deve ser: – rápido; – barato; – o mais eficiente possível, de maneira a se minimizar perdas das substâncias a serem isoladas; – muito eficiente na etapa de purificação.

Importância do processo de isolamento: obter a(s) substância(s) que se deseja com o maior grau de pureza. Mas… o que é pureza? Quão pura deve estar uma substância, para que possa servir ao(s) propósito(s) para o(s) qual(is) foi isolada?

Na verdade, o grau de pureza de uma substância pode ser definida como sendo uma medida da concentração de outras substâncias concomitantemente na mesma amostra.

Como pode ser medida: – HPLC, com detecção por índice de refração ou por UV em 210-220 nm; – RMN, acima de 400 MHz; – CL-EM (LC-MS) ou CG-EM (GC-MS).

Uma amostra com 100% de pureza é muito difícil de ser obtida, devido à presença de: – contaminantes de solventes (ftalatos, estabilizantes); – lipídios: muito difíceis de separar completamente; – detergentes: cuidado na limpeza da vidraria; – outros contaminantes: sais, homólogos, contra-íons.

A origem (fonte biológica) da amostra é importante. Por exemplo, plantas apresentam pigmentos, principalmente clorofilas, difíceis de serem eliminados. Macro-organismos marinhos apresentam muitos lipídios, também de difícil purificação. Já no caso de microrganismos, o difícil é eliminar alguns constituíntes do meio de cultura, principalmente sais.

Impurezas podem ser especialmente problemáticas na realização dos seguintes experimentos: – determinação estrutural (por técnicas tais como RMN e EM), se em concentração próxima à da substância de interesse; – difração de raios X, uma vez que a presença de impurezas impede a formação de cristais; – medida da rotação específica, [α]D, dicroísmo circular ou dispersão ótica rotatória, uma vez que essas medidas são dependentes da concentração; – e, principalmente, ensaios biológicos, onde contaminantes minoritários podem ser muito ativos, enquanto que a substância isolada não o é.

Exemplos:

O ent-kauran-3-oxo-16a,17-diol foi isolado a partir de plantas, e reportado simultaneamente em duas publicações. Um dos artigos apresenta o valor de [α]D –39.2 (CHCl3); o outro, [α]D –73.1 (CHCl3).

terpeno

As axinastatinas 2, 3 e 4, bem como o stylopeptídeo, isolados da esponja Axinella cf. carteri, apresentaram atividade citotóxica em concentrações entre pM e nM. Todavia, as mesmas substâncias, obtidas após a sua síntese, mostraram ser totalmente inativas ou muito pouco ativas. Presume-se que as amostras isoladas estavam contaminadas com alguma substância minoritária muito ativa. Tal fato ocorre com certa frequência.

aula-topico-4-5

Logo, o isolamento de substâncias idealmente 100% puras por RMN-1H e HPLC nem sempre garante que as amostras estão, realmente, isentas de quaisquer contaminantes.

De qualquer forma, o grau de pureza desejado deve ser o melhor possível, de maneira a se minimizar a interferência de contaminantes nos vários tipos de experimentos a serem realizados com substâncias isoladas.

Objetivo final: obter substâncias com o maior grau de pureza possível.

Extrações de matrizes biológicas

/em /por

Extração implica em se obter material orgânico livre de sua matriz original (células e tecidos). O solvente a ser utilizado será escolhido em função do objetivo do trabalho. O material biológico pode ser extraído por diferentes solventes, ou por um único solvente.

A extração por diferentes solventes é utilizada na obtenção de extratos de polaridades crescentes. Por exemplo: hexano à CH2Cl2 à ACOEt à MeOH à H2O.

Também pode-se fazer a extração com um único solvente, mais polar (em geral álcoois), e em seguinda submeter o extrato obtido a uma série de partições. Pode-se utilizar extração em fase sólida (SPE, solid phase extraction), que é particularmente útil para se obter extratos orgânicos a partir de material com alto teor de água (organismos marinhos ou microorganismos crescidos em meio de cultura líquido).

No caso de plantas, em geral o material é seco e triturado antes da extração. Caso seja necessária a extração de material fresco, a extração deve ser feita no ato da coleta. Além disso, o material triturado pode ser tanto extraído a frio como a quente, em Soxhlet. No caso de plantas, pode-se ainda utilizar extração com solventes ácidos (AcOH, HCl) ou alcalinos (NH4OH), em função da natureza química dos compostos que se deseja isolar. Todavia, este método é cada vez menos utilizado, por gerar, no mais das vezes, artefatos de isolamento.

No caso de animais marinhos, o material é geralmente congelado e em seguida liofilizado antes da extração. Comumente, o material pode também ser preservado em álcool (MeOH, EtOH, i-PrOH), e em seguida extraído. Muito mais raramente o material é seco ao ar antes de ser extraído.

De qualquer forma, o método a ser utilizado na extração de material biológico deve atender às premissas:

– fornecer o material desejado na maior quantidade possível;

– tanto quanto possível, livre de contaminantes ou de artefatos; a extração deve ser rápida e econômica.

Alguns exemplos das metodologias de extração utilizadas:

  1. Extração sequencial, com solventes de polaridade crescente.
  1. Extração com solvente polar, seguido de partição com solventes de polaridade crescente.
  1. Extração em fase sólida

Solventes para extração

Hidrocarbonetos: solventes muito tóxicos! (mas muito utilizados para a extração de material lipofílico). Exemplos: hexano, heptano, pentano, tolueno. BENZENO é cancerígeno!

Clorofórmio (CHCl3) e tetracloreto de carbono (CCl4): muito tóxicos. Além disso, CHCl3 gera artefatos de isolamento, devido à presença de HCl. Diclorometano (CH2Cl2) é muito menos tóxico. Todavia, todos os solventes clorados estão sendo banidos de laboratórios por questões de saúde e ecológicas.

Acetato de Etila: muito bom, se livre de ácido acético.

Álcoois: MeOH, EtOH, n-BuOH. Excelentes, baratos, extratores muito eficientes, pois rompem as membranas celulares, extraindo o material intra-celular, o que não é o caso de solventes apolares. Todavia, n-BuOH é difícil de evaporar.

Idealmente, o solvente deve:

  1. a) extrair eficientemente as substâncias que se deseja;
  2. b) ser atóxico e barato e ter ponto de ebulição adequado para se evitar a decomposição térmica das substâncias extraídas.

Métodos de extração

1 – Percolação: o material (seco ou úmido, partido ou triturado) é colocado em um percolador, através o qual se passa um fluxo contínuo do solvente extrator, com um fluxo ideal que permita uma extração eficiente e que o solvente seja constantemente removido. A extração pode ser realizada pela passagem do solvente a quente ou a frio. Exemplo típico de extração por percolação: preparação de café!

2 – Maceração: o solvente é colocado em contato com o material e ser extraído, e deixado em contato durante certo tempo (horas ou dias). Após este período, o solvente deve ser removido por filtração, e o resíduo re-extraído. Em geral, três extrações por maceração são suficientes para que se obtenha um máximo de eficiência extrativa. É o método de extração mais utilizado.

3 – Com o uso de soxhlet: o solvente extrator é continuamente renovado na câmara de extração, por destilação. Principal desvantagem: o aquecimento contínuo do extrato leva frequentemente à decomposição térmica de substâncias pouco estáveis.

4- Extração contínua: após a extração com um solvente apropriado, é necessário re-extrair os solutos do solvente de extração original, de maneira a concentrar os solutos antes de iniciar sua separação. Todavia, o processo de re-extração dos solutos nem sempre é eficiente, requerendo um número muito grande de partições e/ou adsorção em resinas de fase sólida.

Alternativa à extração contínua é o uso de um pequeno volume de solvente re-extrator.

Vantagens:

– Utiliza-se um pequeno volume de solvente re-extrator.

– Recupera grande quantidade dos solutos.

– Pode ser operada por longos períodos.

Fatores limitantes: depende da densidade dos solventes envolvidos na partição, e do coeficiente de partição dos solutos na mistura de solventes a ser utilizada.

Importante:

– A diferença de densidade entre os dois solventes deve ser grande.

– Os solutos devem ser menos voláteis do que o solvente extrator.

– Os solutos devem ser termicamente estáveis nas condições de evaporação do solvente extrator.

Métodos de extração de meios de cultura microbianos

Meios de cultura microbianos podem ou não serem submetidos a um processo de rompimento das células, pela aplicação de uma haste de ultrassom diretamente no meio de cultura. Alternativamente, as células podem ser rompidas após filtração do meio líquido (ver abaixo), e retomada do material retido em MeOH (que promove lise celular).

Meios de cultura podem se apresentar com uma composição variável de substâncias gelatinosas, em geral mucopolissacarídeos provenientes das paredes celulares de bactérias. Esta gelatina pode ser problemática para a filtração do meio de cultura. Por isso, dependendo da concentração destes polímeros no meio de cultura, este deve ser centrifugado ou filtrado para a limpeza do meio de cultura. Após essa limpeza, ambos meios de cultura líquido e resíduo celular devem ser extraídos.

O meio de cultura pode ser extraído:

  1. a) adicionando-se AcOEt, e deixando-se sob agitação antes de se realizar uma partição líquido-líquido;
  2. b) passando-se o meio líquido através de resinas do tipo XAD-2, XAD-4, XAD-7 ou XAD-18, para adsorção do material orgânico, e posterior dessorpção com solventes orgânicos;
  3. c) por extração de fase sólida em fase reversa C18 ou C4 (ver a seguir). Por vezes, é necessário se fazer um ajuste do pH do meio de cultura, de maneira a aumentar a eficiência da extração. Por exemplo, tal é o caso quando da extração de penicilinas do meio de cultura.

O resíduo celular é comumente extraído com solventes orgânicos (AcOEt, MeOH).

Métodos de extração de animais (marinhos ou não), inclusive insetos

O material biológico é, usualmente, preservado em álcool (MeOH, EtOH, i-PrOH) ou congelado. Se congelado, o material deve ser liofilizado antes de ser preservado por longos períodos (muitos meses), bem como antes de ser extraído.

Após sua liofilização, o material biológico pode ser triturado em liquidificador no solvente a ser extraído, ou a sêco se congelado (adicionando-se gêlo sêco no liqüidificador).

Extração:

  1. a) O solvente no qual o animal foi preservado é removido por filtração, e o material é re-extraído com uma quantidade adicional de solvente, triturando-se o material em liquidificador de aço inox. Após 24 h, filtra-se o solvente, adiciona-se novo solvente por mais 24 h.
  2. b) No caso de material preservado sob congelamento, este deve ser liofilizado (se ainda não o foi), podendo então ser extraído:

– ou por solventes de polaridade crescente;

– ou por álcool (usualmente MeOH ou EtOH).

A filtração de esponjas pode ser particularmente problemática, pela presença de espículas do seu esqueleto, que frequentemente obstruem papel de filtro.

Método de extração de animais marinhos, desenvolvido no National Cancer Institute (EUA)

O material biológico congelado é triturado com gêlo sêco e em seguida extraído com H2O. A mistura material biológico + H2O é centrifugada, o sobrenadante é removido e liofilizado. O resíduo biológico é então re-extraído com CH2Cl2-MeOH 1:1, e depois com MeOH.

Interferentes de extração

Lipídios: podem ser removidos:

  1. a) por partição do extrato bruto com hidrocarbonetos;
  2. b) por extração em fase sólida de SiOH;
  3. c) por cromatografia do extrato bruto em SiOH.

Pigmentos podem ser removidos:

  1. a) por adsorção em carvão ativo;
  2. b) por partição do extrato bruto com hidrocarbonetos;
  3. c) por filtração através de celite (terra de diatomáceas).

Taninos (polifenóis): podem ser removidos:

  1. a) por filtração em resina de poliamida, colágeno, Sephadex LH20 ou SiOH gel;
  2. b) por precipitação (seguida de filtração) com solução de gelatina-NaCl (5% m/v NaCl, 0.5% m/v gelatina);
  3. c) por adsorção em polivinilpirrolidona (PVP).

Plastificantes (ftalatos): podem ser eliminados:

  1. a) em se utilizando solventes de melhor qualidade;
  2. b) por extração em fase sólida de fase reversa C18 (se o extrato for polar);
  3. c) ou filtrando o extrato através de alumina (se for apolar)

Importante: estudar bibliografia relacionada ao projeto em investigação.

Sobre separações cromatográficas por CCD – I – solventes e eluentes

/em /por

Químicos de produtos naturais trabalham durante boa parte do tempo otimizando e realizando separações cromatográficas. Porém, muitas vezes investimos um tempo considerável separando e re-separando misturas, as quais poderiam ser resolvidas levando-se em consideração alguns princípios básicos de cromatografia, como:

a) a qualidade dos solventes utilizados;

b) a qualidade das fases estacionárias utilizadas;

c) a seletividade dos solventes utilizados para preparar um eluente;

d) a seletividade da fase estacionária a ser utilizada.

Sobre solventes, podemos verificar que existem vários aspectos. O primeiro é o grau de pureza necessário, de acordo com a separação que se deseja. Obviamente, solventes a serem utilizados em cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) devem ter um grau de pureza muito maior do que solventes a serem utilizados na primeira separação cromatográfica de um extrato bruto. Mesmo assim, o teor de água em solventes polares influencia fortemente na qualidade de uma separação cromatográfica preliminar. Portanto, é desejável que solventes como metanol (MeOH), etanol (EtOH), acetona e até mesmo acetato de etila tenham um baixo teor de água. Para tanto, muitas vezes é necessário secar e destilar os solventes. Se tal procedimento for viável, a literatura (Perrin e Amarego, “Purification of Laboratory Chemicals”, Pergamon Press, 3a edição, 1988) recomenda:

MeOH e EtOH – simplesmente uma destilação cuidadosa pode diminuir o teor de água até 0,01%.

isopropanol (i-PrOH) – normalmente pouco utilizado em cromatografia de coluna (CC), i-PrOH é bastante utilizado em separações por HPLC, e não necessita de purificação se adquirido com grau de pureza cromatográfico.

acetona – pode ter quantidades variáveis de i-PrOH e água. Um bom procedimento é adicionar permanganato de potássio (KMnO4) suficiente para que a coloração roxa persista e simplesmente destilar a mistura. Se muito impura, a “cauda” da destilação se tornará apreciavelmente marrom devido à formação de MnO2.

Solventes apolares apresentam impurezas tais como ftalatos e estabilizantes (no caso de solventes clorados). Para estes, o procedimento de purificação é distinto:

hexano – pode conter quantidades apreciáveis de ftalatos e hidrocarbonetos aromáticos. Para se obter hexano de boa qualidade, idealmente deve ser tratado com uma pequena proporção (cerca de 1 – 5% do volume a ser purificado) de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4) de maneira a promover a sulfonação dos hidrocarbonetos aromáticos. Após separação do H2SO4 em funil de separação, o hexano é lavado com uma solução saturada de bicarbonato de sódio (NaHCO3), depois com água, sêco com cloreto de cálcio (CaCl2) e destilado. Desta maneira se obtém hexano com muito bom grau de pureza.

diclorometano (CH2Cl2): deve ser tratado de maneira idêntica ao hexano.

clorofórmio (CHCl3) – deve ser lavado com água para eventual remoção de EtOH (estabilizante), secagem com CaCl2, destilação e armazenamento em frascos muito escuros, longe da luz. Clorofórmio reage lentamente com oxigênio e luz fornecendo fosgênio (Cl2C=O), cloro (Cl2) e cloreto de hidrogênio (HCl), contaminantes perigosos e que podem promover a degradação de compostos orgânicos suscetíveis a ácidos.

acetato de etila (AcOEt) – as principais impurezas são água, EtOH e ácido acético (AcOH). Pode ser purificado por lavagem com solução saturada de carbonato de sódio (Na2CO3), sêco com sulfato de cálcio (CaSO4) ou sulfato de magnésio (MgSO4) e destilado.

éter etílico (Et2O) – este solvente pode conter principalmente quantidades apreciáveis de EtOH e água, mas também peróxido de dietila (Et-O-O-Et) e aldeídos. A obtenção de Et2O de boa qualidade é trabalhosa. Um litro de Et2O deve ser agitado com uma solução de 110 mL de água contendo 6 g de sulfato ferroso (FeSO4) e 6 mL de H2SO4 concentrado. Após a separação das fases, o Et2O deve ser lavado com água, seco por 24 h com CaCl2 e destilado. O solvente purifiado deve ser guardado no escuro e utilizado no máximo em alguns dias.

Outros solventes que podem ser utilizados em misturas eluentes são: tolueno (metilbenzeno), tetraidrofurano (THF), dioxano, dimetilformamida (apenas para cromatografia em camada delgada, CCD), acetonitrila (MeCN), n-butanol. Estes podem ser adquiridos com bom grau de pureza (e são caros). No caso de THF e dioxano, estes devem ser também guardados no escuro, pois, tal como Et2O, podem formar peróxidos quando guardados por períodos prolongados.

Eluentes preparados com solventes de bom grau de pureza fornecem melhores separações cromatográficas.

Eluentes utilizados para cromatografia em modo normal (fase estacionária polar – fase móvel apolar) podem apresentar composições as mais variadas, dependendo da classe de compostos que se deseja separar. Estes variam desde lipídios (muito apolares) até aminoácidos (muito polares). Usualmente se utiliza cromatografia em modo normal para análises por cromatografia em camada delgada (CCD), que podem (e devem!) ser utilizadas para se escolher o eluente mais apropriado para separações por cromatografia em coluna (CC) em modo normal. Levando-se em conta que a fase estacionária de longe mais utilizada em CCD é sílica gel, boas misturas eluentes são (por ordem de polaridade):

misturas binárias:

  1. hexano-CH2Cl2

  2. hexano-AcOEt

  3. hexano-acetona

  4. hexano-isopropanol

  5. CH2Cl2-AcOEt

  6. CH2Cl2-acetona

  7. CH2Cl2-isopropanol

  8. CH2Cl2-MeOH

  9. CH2Cl2-THF

  10. CH2Cl2-MeCN

  11. AcOEt-MeOH

  12. tolueno-acetona

  13. tolueno-AcOEt

  14. acetona-H2O

  15. EtOH-hidróxido de amônio (NH4OH)

misturas ternárias:

  1. hexano- CH2Cl2-AcOEt

  2. CH2Cl2-AcOEt-MeOH

  3. CH2Cl2-MeOH-DMF

  4. CHCl3-MeOH-AcOH (poucas gotas deste último) – para substâncias com caráter ácido

  5. n-BuOH-AcOH-H2O – idem

  6. EtOAc/MeOH/NH4OH (poucas gotas deste último) – para substâncias de caráter alcalino

misturas quaternárias:

  1. hexano- CH2Cl2-AcOEt-MeOH

  2. hexano-isopropanol-AcOEt-MeOH

Vale a pena usar a imaginação, de maneira criteriosa. A bíblia sobre cromatografia em camada delgada ainda é o livro de Egon Stahl, “Thin Layer Chromatography”, Springer-Verlag, 1969. Não conheço outro melhor.

A importância de se estudar produtos naturais

/em /por

No meu entender, são MUITAS as razões para se estudar os componentes do metabolismo secundário, também chamados de produtos naturais. A seguir, listo algumas que me parecem boas. Gostaria de que outras fossem adicionadas à esta lista.

– Conhecer a ocorrência de produtos do metabolismo secundário, suas características físicas (espectroscópicas) e químicas (acidez, basicidade, reatividade).

– Devido à sua distribuição restrita em determinados grupos taxonômicos (táxons), relacionar sua ocorrência com a classificação biológica dos organismos que as produzem e/ou acumulam (quimiotaxonomia).

– Em consequência, pode-se inferir a respeito da filogenia (evolução) dos organismos, em função destes apresentarem determinados grupos de produtos naturais, relacionados entre si, o que significa de organismos que apresentam grupos de produtos naturais similares podem ser filogeneticamente (evolutivamente) relacionados. A ocorrência de determinadas substâncias em táxons bem definidos pode ajudar na determinação da história evolutiva (filogenia) do grupo, bem como a sua posição taxonômica e filogenética com relação a outros táxons.

– Conhecer a forma através da qual essas substâncias são formadas, ou a sua biossíntese. O conhecimento da biossíntese de produtos naturais permite que se estabeleça as rotas biogenéticas gerais para a sua formação, bem como os precursores, os intermediários e as enzimas que participam desse processo. Em última instância, o genoma responsável pela codificação de sua biossíntese.

– Conhecer a contribuição dessas substâncias e de sua biossíntese para a economia metabólica do organismo que a produz, a forma através da qual o organismo armazena e libera essas substâncias.

– A(s) função(ões) fisiológica(s) e ecológica(s) dessas substâncias para os organismos que as produzem, de maneira a compreender sua atuação como mediadores químicos em processos intraespecíficos (Biologia Química) ou inter-específicos (Ecologia Química).

– Conhecer o potencial de aplicação econômica dessas substâncias (produtos naturais), e sua aplicação como:

a. aditivos em alimentos: vitaminas, corantes, flavorizantes, aromatizantes e antioxidantes);

b. medicamentos;

c. agroquímicos (pesticidas, herbicidas, inseticidas);

d. venenos;

e. ferramentas bioquímicas.

f. cosméticos

– Desenvolver novos métodos para a sua detecção, análise e identificação.

– Desenvolver novas metodologias de reações orgânicas e de síntese orgânica, que permitem a transformação de grupos funcionais, formação de ligações carbono-carbono e a síntese de moléculas complexas ou estruturalmente únicas.

– Utilizar produtos naturais como base para o desenvolvimento de novos materiais.

Algo mais?

Metabolismo secundário e produtos naturais

/em /por

Segundo Geissman e Crout (Organic Chemistry of Secondary Plant Metabolism, 1969), substâncias do metabolismo secundário são de natureza relativamente complexa e distribuição restrita, ao contrário das substâncias do metabolismo primário que apresentam uma distribuição universal. Poucos produtos naturais possuem uma função característica bem determinada no metabolismo dos organismos que as produzem. Contudo, também não podem ser considerados como “lixo metabólico”, “anomalias funcionais”, ou ainda produtos finais de degradação do metabolismo primário. Sua função é desconhecida pela nossa incapacidade de estabelecê-la.

Segundo Luckner (Secondary Metabolism in Plants and Animals, 1972), o metabolismo secundário é constituído por uma infinidade de substâncias que em geral são consideradas produtos de excreção, fonte de energia ou produtos de estocagem (?) sem qualquer importância para os organismos que as produzem.

Segundo Martin e Demain (in The Filamentous Fungi, 1978, vol. III), no caso de microorganismos, metabolitos secundários são os produtos do metabolismo que são quase sempre produzidos após a fase de crescimento, não apresentando função durante o crescimento, embora possam apresentar função essencial para a sobrevivência da linhagem (ex., antibióticos). São produzidos por grupos específicos de microorganismos, apresentam estruturas químicas pouco usuais, e quase sempre ocorrem na forma de misturas de compostos muito semelhantes.

Segundo Mann (Secondary Metabolism, 1980), os produtos do metabolismo secundário são substâncias pretencentes a um único organismo, ou a um pequeno grupo de organismos [geneticamente] relacionados. Na maioria das vezes, são substâncias que não são absolutamente essenciais para a manutenção da vida dos organismos que as contém, em contraste aos outros compostos de origem natural, açúcares, aminoácidos, nucleotídeos e seus respectivos polímeros, os quais são todos essenciais e ubíquos (de ampla ocorrência).

Segundo Herbert (The Biosynthesis of Secondary Metabolites, 1981), substâncias do metabolismo primário constituem as principais vias de uma linha de trem; as substâncias do metabolismo secundário constituem as ramificações dessas linhas, e aonde chegam a seu termo. Produtos do metabolismo secundário podem ser distingüidos daqueles do metabolismo primário, de acordo com as seguintes premissas:

– apresentam distribuição restrita, sendo limitadas a plantas e microorganismos, sendo ainda restritas a grupos pertencentes a um mesmo gênero, espécie ou linhagem;

– são formadas a partir das substâncias do metabolismo primário;

– não são essenciais para a manutenção da vida, sendo, porém, importantes para os organismos que as produzem. Qual é essa importância? Boa pergunta.

– são formadas a partir de um número limitado de substâncias do metabolismo primário: aminoácidos, acetil-coenzima A, ácido mevalônico, e intermediários do metabolismo do ácido shiquímico.

Segundo Manitto (Biosynthesis of Natural Products, 1981), produtos naturais são substâncias que não são essenciais para a existência dos indivíduos como tais, mas que exercem uma função fundamental para a sobrevivência da espécie. A real razão para a sua produção é desconhecida.

Segundo Torsell (Natural Products Chemistry, 1983), produtos do metabolismo secundário são característicos de um determinado grupo biológico, tal como uma determinada família ou gênero, e a forma pela qual são biossintetizados é resultado da história evolutiva do(s) organismo(s) que as produzem. Sua real função é, no mais das vezes, desconhecida. Porém, não são “lixo metabólico”, em vista do fato que vários produtos naturais são acumulados em quantidades apreciáveis pelos organismos que os produzem. Produtos naturais podem ser considerados como substância de pouco ou nenhum valor nutricional, e que controlam a biologia de outras espécies no ambiente em que se encontram. Em outras palavras, produtos naturais apresentam uma função fundamental na co-existência e na co-evolução das espécies biológicas, podendo atuar como:

– mediadores de atração sexual;

– estimulantes de consumo (feedants), ou inibidores de consumo (anti-feedants), repelentes ou toxinas;

– mecanismos de defesa e de alarme (em animais);

– mediadores químicos nos processos de desenvolvimento, metamorfose, estimuladores ou supressores de crescimento;

– mediadores em processos de interação social, agindo como agentes estimulantes de construção (cupins); marcadores territoriais (abelhas); indicadores de trilhas (formigas), etc.

Segundo Davies (in Microbiology, 1985), a definição mais simples de produtos do metabolismo secundário é que estes não se encontram nos mapas metabólicos do metabolismo primário.

Segundo Bennett e Bentley (in Advances in Applied Microbiology, 1989, 34, 1), produtos do metabolismo secundário constituem intermediários ou produtos metabólicos, quase sempre (mas nem sempre!) restritos a grupos taxonômicos específicos, sendo biossintetizados a partir de um ou mais precursores metabólicos através de uma série de reações enzimáticas.

Segundo Luckner (Secondary Metabolism in Microorganisms, Plants and Animals, 1990) a biossíntese de produtos secundários é, no mais das vezes, pouco onerosa para as células que a realizam (!!), porém essas substâncias apresentam funções essenciais no desenvolvimento e função (?) do organismo que as produz. As principais características dessas substâncias são:

– a sua distribuição taxonômica restrita;

– sua formação (biossíntese), envolvendo enzimas específicas;

– a compartimentalização (em vesículas e organelas especializadas) das enzimas, dos precursores, intermediários e produtos envolvidos na sua biossíntese;

– controle da biossíntese, através da disponibilização das enzimas responsáveis por sua realização;

– a expressão do metabolismo secundário (produção e liberação intra-celular e extra-celular) em função da fase do crescimento e do desenvolvimento do organismo produtor;

– a enorme variação estrutural de substâncias estruturalmente relacionadas;

– a pouca importância dessas substâncias para as células que as produzem, mas sendo primordiais para o organismo como um todo (?).

Segundo Vining (in Secondary Metabolites: their function and evolution, 1992), 1. No caso de microorganismos, metabolitos secundários não são essenciais para o crescimento e tendem a ser espécie-específicos; 2. Apresentam uma grande variedade estrutural e de atividades biológicas; 3. São formados através de rotas biossintéticas particulares, a partir de produtos do metabolismo primário e intermediários.

Segundo Hunter (in Trends in Biotechnology, 1992, 10, 144), no caso de microorganismos, o metabolismo secundário é constituído por rotas bioquímicas que são desnecessárias para o crescimento e reprodução, mas tas rotas são constitutivas e parte da expressão genética, fisiológica de bioquímica de um ou um grupo de organismos.

Considerando os pontos apresentados por estes autores, podemos propor uma definição geral para os produtos do metabolismo secundários (denominados ‘produtos naturais’ ou ‘metabólitos secundários’):

– São substâncias distintas dos blocos bioquímicos comuns a todos os seres vivos: açúcares, nucleosídeos, aminoácidos e seus respectivos polímeros.

– Apresentam distribuição restrita a um grupo, ou grupos, genetica e taxonomicamente relacionados.

– Exercem, em geral, atividades extra-celulares alheias às células que as produzem.

– Apresentam, via de regra, funções fisiológicas e adaptativas.

– São formadas através de rotas bioquímicas caraterísticas.

– No caso de microorganismos, exercem funções outras que relacionadas ao crescimento e desenvolvimento do microorganismo, sendo em geral produzidas após o crescimento.