Extrações de matrizes biológicas

Extração implica em se obter material orgânico livre de sua matriz original (células e tecidos). O solvente a ser utilizado será escolhido em função do objetivo do trabalho. O material biológico pode ser extraído por diferentes solventes, ou por um único solvente.

A extração por diferentes solventes é utilizada na obtenção de extratos de polaridades crescentes. Por exemplo: hexano à CH2Cl2 à ACOEt à MeOH à H2O.

Também pode-se fazer a extração com um único solvente, mais polar (em geral álcoois), e em seguinda submeter o extrato obtido a uma série de partições. Pode-se utilizar extração em fase sólida (SPE, solid phase extraction), que é particularmente útil para se obter extratos orgânicos a partir de material com alto teor de água (organismos marinhos ou microorganismos crescidos em meio de cultura líquido).

No caso de plantas, em geral o material é seco e triturado antes da extração. Caso seja necessária a extração de material fresco, a extração deve ser feita no ato da coleta. Além disso, o material triturado pode ser tanto extraído a frio como a quente, em Soxhlet. No caso de plantas, pode-se ainda utilizar extração com solventes ácidos (AcOH, HCl) ou alcalinos (NH4OH), em função da natureza química dos compostos que se deseja isolar. Todavia, este método é cada vez menos utilizado, por gerar, no mais das vezes, artefatos de isolamento.

No caso de animais marinhos, o material é geralmente congelado e em seguida liofilizado antes da extração. Comumente, o material pode também ser preservado em álcool (MeOH, EtOH, i-PrOH), e em seguida extraído. Muito mais raramente o material é seco ao ar antes de ser extraído.

De qualquer forma, o método a ser utilizado na extração de material biológico deve atender às premissas:

– fornecer o material desejado na maior quantidade possível;

– tanto quanto possível, livre de contaminantes ou de artefatos; a extração deve ser rápida e econômica.

Alguns exemplos das metodologias de extração utilizadas:

  1. Extração sequencial, com solventes de polaridade crescente.
  1. Extração com solvente polar, seguido de partição com solventes de polaridade crescente.
  1. Extração em fase sólida

Solventes para extração

Hidrocarbonetos: solventes muito tóxicos! (mas muito utilizados para a extração de material lipofílico). Exemplos: hexano, heptano, pentano, tolueno. BENZENO é cancerígeno!

Clorofórmio (CHCl3) e tetracloreto de carbono (CCl4): muito tóxicos. Além disso, CHCl3 gera artefatos de isolamento, devido à presença de HCl. Diclorometano (CH2Cl2) é muito menos tóxico. Todavia, todos os solventes clorados estão sendo banidos de laboratórios por questões de saúde e ecológicas.

Acetato de Etila: muito bom, se livre de ácido acético.

Álcoois: MeOH, EtOH, n-BuOH. Excelentes, baratos, extratores muito eficientes, pois rompem as membranas celulares, extraindo o material intra-celular, o que não é o caso de solventes apolares. Todavia, n-BuOH é difícil de evaporar.

Idealmente, o solvente deve:

  1. a) extrair eficientemente as substâncias que se deseja;
  2. b) ser atóxico e barato e ter ponto de ebulição adequado para se evitar a decomposição térmica das substâncias extraídas.

Métodos de extração

1 – Percolação: o material (seco ou úmido, partido ou triturado) é colocado em um percolador, através o qual se passa um fluxo contínuo do solvente extrator, com um fluxo ideal que permita uma extração eficiente e que o solvente seja constantemente removido. A extração pode ser realizada pela passagem do solvente a quente ou a frio. Exemplo típico de extração por percolação: preparação de café!

2 – Maceração: o solvente é colocado em contato com o material e ser extraído, e deixado em contato durante certo tempo (horas ou dias). Após este período, o solvente deve ser removido por filtração, e o resíduo re-extraído. Em geral, três extrações por maceração são suficientes para que se obtenha um máximo de eficiência extrativa. É o método de extração mais utilizado.

3 – Com o uso de soxhlet: o solvente extrator é continuamente renovado na câmara de extração, por destilação. Principal desvantagem: o aquecimento contínuo do extrato leva frequentemente à decomposição térmica de substâncias pouco estáveis.

4- Extração contínua: após a extração com um solvente apropriado, é necessário re-extrair os solutos do solvente de extração original, de maneira a concentrar os solutos antes de iniciar sua separação. Todavia, o processo de re-extração dos solutos nem sempre é eficiente, requerendo um número muito grande de partições e/ou adsorção em resinas de fase sólida.

Alternativa à extração contínua é o uso de um pequeno volume de solvente re-extrator.

Vantagens:

– Utiliza-se um pequeno volume de solvente re-extrator.

– Recupera grande quantidade dos solutos.

– Pode ser operada por longos períodos.

Fatores limitantes: depende da densidade dos solventes envolvidos na partição, e do coeficiente de partição dos solutos na mistura de solventes a ser utilizada.

Importante:

– A diferença de densidade entre os dois solventes deve ser grande.

– Os solutos devem ser menos voláteis do que o solvente extrator.

– Os solutos devem ser termicamente estáveis nas condições de evaporação do solvente extrator.

Métodos de extração de meios de cultura microbianos

Meios de cultura microbianos podem ou não serem submetidos a um processo de rompimento das células, pela aplicação de uma haste de ultrassom diretamente no meio de cultura. Alternativamente, as células podem ser rompidas após filtração do meio líquido (ver abaixo), e retomada do material retido em MeOH (que promove lise celular).

Meios de cultura podem se apresentar com uma composição variável de substâncias gelatinosas, em geral mucopolissacarídeos provenientes das paredes celulares de bactérias. Esta gelatina pode ser problemática para a filtração do meio de cultura. Por isso, dependendo da concentração destes polímeros no meio de cultura, este deve ser centrifugado ou filtrado para a limpeza do meio de cultura. Após essa limpeza, ambos meios de cultura líquido e resíduo celular devem ser extraídos.

O meio de cultura pode ser extraído:

  1. a) adicionando-se AcOEt, e deixando-se sob agitação antes de se realizar uma partição líquido-líquido;
  2. b) passando-se o meio líquido através de resinas do tipo XAD-2, XAD-4, XAD-7 ou XAD-18, para adsorção do material orgânico, e posterior dessorpção com solventes orgânicos;
  3. c) por extração de fase sólida em fase reversa C18 ou C4 (ver a seguir). Por vezes, é necessário se fazer um ajuste do pH do meio de cultura, de maneira a aumentar a eficiência da extração. Por exemplo, tal é o caso quando da extração de penicilinas do meio de cultura.

O resíduo celular é comumente extraído com solventes orgânicos (AcOEt, MeOH).

Métodos de extração de animais (marinhos ou não), inclusive insetos

O material biológico é, usualmente, preservado em álcool (MeOH, EtOH, i-PrOH) ou congelado. Se congelado, o material deve ser liofilizado antes de ser preservado por longos períodos (muitos meses), bem como antes de ser extraído.

Após sua liofilização, o material biológico pode ser triturado em liquidificador no solvente a ser extraído, ou a sêco se congelado (adicionando-se gêlo sêco no liqüidificador).

Extração:

  1. a) O solvente no qual o animal foi preservado é removido por filtração, e o material é re-extraído com uma quantidade adicional de solvente, triturando-se o material em liquidificador de aço inox. Após 24 h, filtra-se o solvente, adiciona-se novo solvente por mais 24 h.
  2. b) No caso de material preservado sob congelamento, este deve ser liofilizado (se ainda não o foi), podendo então ser extraído:

– ou por solventes de polaridade crescente;

– ou por álcool (usualmente MeOH ou EtOH).

A filtração de esponjas pode ser particularmente problemática, pela presença de espículas do seu esqueleto, que frequentemente obstruem papel de filtro.

Método de extração de animais marinhos, desenvolvido no National Cancer Institute (EUA)

O material biológico congelado é triturado com gêlo sêco e em seguida extraído com H2O. A mistura material biológico + H2O é centrifugada, o sobrenadante é removido e liofilizado. O resíduo biológico é então re-extraído com CH2Cl2-MeOH 1:1, e depois com MeOH.

Interferentes de extração

Lipídios: podem ser removidos:

  1. a) por partição do extrato bruto com hidrocarbonetos;
  2. b) por extração em fase sólida de SiOH;
  3. c) por cromatografia do extrato bruto em SiOH.

Pigmentos podem ser removidos:

  1. a) por adsorção em carvão ativo;
  2. b) por partição do extrato bruto com hidrocarbonetos;
  3. c) por filtração através de celite (terra de diatomáceas).

Taninos (polifenóis): podem ser removidos:

  1. a) por filtração em resina de poliamida, colágeno, Sephadex LH20 ou SiOH gel;
  2. b) por precipitação (seguida de filtração) com solução de gelatina-NaCl (5% m/v NaCl, 0.5% m/v gelatina);
  3. c) por adsorção em polivinilpirrolidona (PVP).

Plastificantes (ftalatos): podem ser eliminados:

  1. a) em se utilizando solventes de melhor qualidade;
  2. b) por extração em fase sólida de fase reversa C18 (se o extrato for polar);
  3. c) ou filtrando o extrato através de alumina (se for apolar)

Importante: estudar bibliografia relacionada ao projeto em investigação.