Revisão por Pares: Essencial para a Boa Ciência

Em meu antigo blog, “química de produtos naturais”, mantido entre 2009 e 2012, posts sobre a revisão por pares e sua importância foram tema constante. Os textos “Ciência Profissional”, “A avaliação por pares… transparente“, “O que está acontecendo com a revisão por pares?“, e “Avaliar a avaliação por pares?” foram alguns dos postados no “química de produtos naturais”, e ilustram a importância do processo de revisão por pares.

Por isso, foi com grata satisfação que recebi certificado de revisor “top” do Journal of the Brazilian Chemical Society em 2016. Considero que uma boa revisão por pares é essencial para a realização da boa ciência. Agradeço à editoria do Journal of the Brazilian Chemical Society pela consideração pelo meu trabalho. Muito obrigado.

Roberto G. S. Berlinck

Derivados da dibromotirosina pela primeira vez produzidos por bactéria

Esponjas marinhas são os animais mais primitivos da Terra, tendo supostamente surgido há entre 500 milhões e 1 bilhão de anos. Este longo período de evolução possibilitou as esponjas marinhas a estabelecer associações estáveis e mutuamente benéficas com uma grande diversidade de micro-organismos. Estas associações são essenciais para a manutenção fisiológica e ecológica das esponjas, e também contribuem de maneira significativa para o sucesso ecológico destes animais no ambiente em que se encontram.

Quando a química destes animais começou a ser sistematicamente investigada há cerca de 50 anos, se observou que a química dos metabólitos secundários isolados destes animais é extremamente particular. Esponjas marinhas acumulam classes únicas e exclusivas de metabólitos secundários: alcaloides alquilpiridínicos e alquilpiperidínicos, alcaloides bromopirrólicos, alcaloides guanidínicos e alcaloides derivados da dibromotirosina, além de uma enorme diversidade de terpenos, policetídeos, derivados do ácido shiquímico, e outros metabólitos diversos.

À medida em que informações foram acumuladas sobre a química de esponjas, se verificou que vários metabólitos destes animais foram também isolados de meios de cultivo de micro-organismos diversos, não necessariamente isolados de esponjas. O fato de se encontrar as mesmas substâncias, ou substâncias muito parecidas, em esponjas e meios de cultivo de micro-organismos, levou os cientistas a postularem que os metabólitos de esponjas são, na verdade, produzidos por micro-organismos associados.

Neste trabalho, reportamos pela primeira vez o isolamento de derivados de dibromotirosina a partir do meio de cultivo de uma bactéria, Pseudovibrio denitrificans Ab134. Derivados de dibromotirosina são substâncias comumente isoladas de esponjas marinhas, principalmente da Ordem Verongida. A bactéria aqui estudada foi isolada a partir da esponja Arenosclera brasiliensis (Ordem Haplosclerida). A produção de dibromotirosinas por P. denitrificans Ab134 isolada de A. brasiliensis é extremamente surpreendente, e resolve o problema da origem destes metabólitos estruturalmente únicos. A importância deste trabalho é muito significativa para a comunidade de químicos de produtos naturais marinhos, microbiologistas marinhos, espongólogos e outros especialistas que se dedicam a investigar a química de associações simbióticas.

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A realização deste trabalho só foi possível devido à dedicação de todos alunos envolvidos, em especial a Karen J. Nicácio. A excelente colaboração com os grupos dos Professores Fabiano Thompson (UFRJ), Eduardo Hajdu (UFRJ), Antonio G. Ferreira (UFSCar), Raymond J. Andersen (University of British Columbia), Alessandra Eustáquio (University of Illinois, Chicago), foi também de extrema importância. O sequenciamento do genoma de P. denitrificans Ab134 já foi realizado, objetivando investigar os genes que codificam a biossíntese dos derivados da dibromotirosina produzidos por esta bactéria. Leia nosso trabalho, aqui.

Primeiro Isolamento de Terpenos Nitrogenados de um Nudibrânquio

Nudibrânquios são moluscos exclusivamente marinhos desprovidos de concha. As conchas de moluscos servem para proteção física contra predadores e também para manter a temperatura corporal destes animais. Os moluscos nudibrânquios perderam suas conchas ao longo da evolução. A hipótese que melhor explica a perda da concha por estes animais é que estes se alimentam de outros invertebrados, como esponjas, ascídias, corais, briozoários, e outros moluscos, e sequestram produtos químicos de suas prêsas em benefício próprio: para se defenderem de seus predadores. Inúmeros estudos corroboram esta hipótese.

Neste trabalho realizado em colaboração com os Drs. Vinícius Padula e Eduardo Hajdu, observamos que o nudibrânquio Felimida grahami se alimenta da esponja Darwinella cf. oxeata. A investigação química destes animais levou ao isolamento de uma série de terpenos nitrogenados, dos quais a oxeatina apresenta um novo esqueleto de carbono, e a oxeatamida J apresenta um grupo N-metil uréia, muito raro em produtos naturais. Outras oxeatamidas também foram isoladas, além do membranolídeo. A composição química do manto do molusco, região externa onde as substâncias de proteção se acumulam, foi investigada utilizando-se análises por UPLC-QTOF, indicando a presença de 3 dos terpenos isolados da esponja. O membranolídeo também apresentou atividade contra Trypanosoma cruzi moderada. Leia nosso trabalho, aqui.

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foto: Eduardo Hajdu

Processo “detox” de fungos resulta de adição de Michael do mercaptopiruvato em enona da alfa,beta-dehidrocurvularina

Processo de detoxificação do fungo Penicillium sp. descrito neste ano de 2016 resulta da adição de mercaptopiruvato no grupo enona da alfa,beta-dehidrocurvularina. Esta descoberta se sucedeu durante a investigação dos metabólitos minoritários produzidos pelo fungo em meio de cultura. De maneira a se incrementar a produção dos metabólitos minoritários, foi aplicada metodologia de planejamento experimental e análise quimiométrica utilizando-se planejamento fatorial fracionário. Experimentos de crescimento do fungo em condições otimizadas levaram à formação de derivados da alfa,beta-dehidrocurvularina que apresentam um anel tetrahidrotiofeno, as ciclotiocurvularinas. Após a identificação das ciclotiocurvularinas por análise espectroscópica (RMN, HRMS e IV), bem como por difração de raios-X, foram realizados experimentos de incorporação de [U-13C]cisteína. Estes experimentos objetivaram confirmar a biossíntese do ciclo tetrahidrotiofeno. Foi observada taxa de incorporação excessivamente alta (99%) do precursor isotopicamente marcado, sugerindo que este seria incorporado por um processo puramente químico, e não regulado enzimaticamente. Experimentos adicionais utilizando-se uma transaminase, a cisteína e a alfa,beta-dehidrocurvularina confirmaram tais hipóteses: a transformação da cisteína em mercaptopiruvato e a reação deste com alfa,beta-dehidrocurvularina constituem processo de eliminação do policetídeo citotóxico quando este é produzido em altas concentrações, um claro processo de detoxificação fúngico. Este trabalho foi realizado durante o doutorado do hoje Dr. Marcos Castro e do mestrado da aluna de doutorado Laura Pavan Ióca. Leia o artigo completo, aqui.

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A enzima oxaD de Penicillium oxalicum oxida indóis formando nitronas

Estudo realizado durante estágio sabático no grupo do Professor David H. Sherman do Life Sciences Institute (University of Michigan) resultou na descoberta da enzima oxaD, que promove a oxidação da roquefortina C formando roquefortina L. A roquefortina L é uma nitrona, grupo bastante raro de metabólitos secundários, dos quais até o momento se conhecem apenas 7 alcaloides, todos produzidos por fungos. A oxaD foi expressa a partir do agregado gênico (gene cluster) de Penicillium oxalicum que codifica a biossíntese da oxalina. Utilizando estratégia de expressão heteróloga em Escherichia coli eletrocompetente, a oxaD foi produzida em larga escala para que seu mecanismo de ação e flexibilidade estrutural de seu substrato natural (roquefortina C) pudessem ser investigados. Derivados da roquefortina C preparados por reações simples demonstraram ser oxidados pela enzima oxaD em maior ou menor extensão, dependendo da variação estrutural da roquefortina C. Derivados indólicos estruturalmente mais diversos não são oxidados por oxaD. A formação da roquefortina L a partir da roquefortina C promovida por oxaD é uma das etapas da biossíntese dos alcaloides oxalina e meleagrina. Este estudo foi realizado por Stelamar Romminger (bolsista CAPES), Sean Newmister (pesquisador de pós-doutorado do grupo do Prof. David Sherman), Claire Gober (aluna de doutorado da Professora Madeleine Joullié), eu mesmo (na bancada!) e outros colaboradores. O estágio sabático foi financiado pela FAPESP, enquanto que o pós-doutorado da Dra. Stelamar Romminger foi financiado pela CAPES. Leia nosso artigo, aqui.

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Derivados de alcaloides guanidínicos também matam Leishmania infantum e Trypanosoma cruzi

Publicado no segundo semestre deste ano, estudo realizado por nosso grupo de colaboração coordenado pelo Dr. André Tempone do Instituto Adolfo Lutz demonstrou que derivados mais simples dos alcaloides guanidínicos isolados da esponja Monanchora arbuscula também matam os parasitas Leishmania (L.) infantum e Trypanosoma cruzi. Os derivados guanidínicos ilustrados induzem despolarização do potencial da membrana de mitocôndrias de Leishmania (L.) infantum, aumentam os níveis de espécies reativas de oxigênio e aumentam a permeabilidade da membrana plasmática dos mesmos parasitas. Os mesmos compostos promovem atividade anti-inflamatória em macrófagos infectados com Leishmania (L.) infantum co-cultivados com esplenócitos, reduzindo a produção das citocinas MCP-1 e γ-IFN. Os derivados guanidínicos ilustrados afetam o metabolismo bioenergético de Leishmania, de maneira a eliminar os parasitas de forma seletiva. O apoio financeiro da parte brasileira deste trabalho é da FAPESP (projeto temático 2013/50228-8, e bolsas de estudo 2011/23703-1 e 2013/07275-5) e do CNPq.  Leia nosso artigo, aqui.

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Novo review sobre guanidinas – 2012 a 2014

Agora no início do ano publicamos em colaboração com a Dra. Stelamar Romminger atualização de review sobre guanidinas de origem natural. Este novo review, publicado na revista Natural Product Reports, corresponde ao nono desta série, e que completa 20 anos de revisão da literatura sobre guanidinas de origem natural. São discutidas guanidinas de origem bacteriana, fúngica, de invertebrados marinhos, invertebrados terrestres e plantas. Os estudos de ecologia de animais que acumulam tetrodotoxina (TTX) é um dos tópicos mais extensos do review. Vários exemplos de peptídeos não-ribossomais contendo resíduos de arginina modificados ou não também são de particular interêsse. O review tem 34 páginas, e a foto de destaque foi gentilmente disponibilizada pelo Dr. Craig Williams (University of South Australia), e ilustra a serpente Thamnophis sirtali tentando se alimentar da salamandra Taricha granulosa, que apresenta altas concentrações de TTX. Aproveite a leitura!

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DOI: 10.1039/C5NP00108K

Isolamento, Estrutura e Biossíntese do Roussoellatídeo

Em outubro de 2015 nosso grupo publicou o isolamento, identificação e biogênese do roussoellatídeo, produzido em meio de cultura pelo fungo Roussoella sp. Este policetídeo apresenta um padrão incomum de substituição de grupos metila no anel ciclohexeno, que nos levou a investigar sua biossíntese utilizando precursores marcados com 13c. Os resultados indicaram uma rota de biogênese totalmente nova, que envolve dois rearranjos do tipo Favorskii, um levando à formação do anel ciclopenteno e outro à formação do anel ciclohexeno. Aproveite a leitura!

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http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.orglett.5b02060

 

Publicações recentes de 2015, até setembro

Nossos artigos publicados neste ano de 2015, até o início de setembro, incluem:

1. O isolamento de alcaloides guanidínicos e pirimidínicos da esponja marinha Monanchora arbuscula. Este artigo é fruto do doutorado de Mario F. C. Santos, em colaboração com vários outros pesquisadores. Mario decidiu enfrentar o desafio de isolar estes alcaloides, que são muito polares, alguns solúveis em água, que ocorrem em misturas complexas, contendo homólogos e substâncias muito parecidas umas com as outras, desenvolvendo metodologia inteligente. O projeto incluiu a utilização de resinas XAD-4 e XAD-7 para extrair substâncias hidrossolúveis da fração aquosa desta esponja, além de outras separações em colunas com fases estacionárias do tipo DIOL, C8 e C18. A fração hidrossolúvel forneceu a monalidina, um alcaloide com novo esqueleto de carbono, cuja estrutura foi confirmada após sua síntese total ser realizada por Phil Harper no grupo do Professor Patrick Murphy (Bangor University, País de Gales). Além da monalidina, outros alcaloides isolados por Mario incluem: a arbusculidina, pertencente à classe das ptilocaulinas, o primeiro desta série que apresenta um anel benzeno em sua estrutura; a batzellamida A, o primeiro alcaloide das batzelladinas que não apresenta cadeia alifática; as hemibatzelladinas, também inéditas, que são “metade” de alcaloides correlatos; bem como as batzelladinas D, F, L e nor-batzelladina L. Estes quatro, além da monalidina, foram testados em parasitas de Leishmania infantum e Trypanosoma cruzi pelo Dr. André Tempone, do Instituto Adolfo Lutz (São Paulo), e apresentaram potente atividade leishmanicida. A batzelladina L e a nor-batzelladina L tiveram seu mecanismo de ação contra L. infantum investigados. Não deixe de ler. E fique ligado, pois resultados adicionais deste estudo deverão aparecer em breve.

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Esta foto mostra M. arbuscula (vermelha) ao lado de outra espécie de esponja (laranja), ainda não descrita. A foto é do Prof. Eduardo Hajdu, do Museu Nacional da UFRJ, e compõe o conjunto de fotografias obtidas durante uma de nossas coletas no Rio de Janeiro. Visite o blog TAXPO, do Prof. Hajdu, e veja várias outras fotografias desta coleta.

2. O estudo de substâncias alelopáticas de Drymis brasiliensis. Este estudo foi realizado pela Dra. Simoni Anese, a Luciana Jatobá (que é atualmente aluna de doutorado), ambas do laboratório da Professora Sônia Gualtieri, do Departamento de Botânica da UFSCar. Mario, de novo, trabalhou junto com Simoni e a Luciana, isolando as substâncias de D. brasiliensis responsáveis por sua atividade herbicida. O isolamento foi todo biomonitorado, e levou ao isolamento do poligodial e dois outros derivados, como sendo os compostos responsáveis pela atividade herbicida.

3. O projeto de mestrado de Julie Paulin, estudante vinda da Colômbia para realizar o mestrado (e agora o doutorado), foi iniciado anteriormente pela aluna Isadora Sabater, bolsista de Iniciação Científica da FAPESP. O projeto foi sugerido e realizado em colaboração com a Profa. Lara D. Sette. O grupo da Profa. Lara descobriu um fungo do ambiente marinho, Tinctoporellus sp. CBMAI 1061, que degrada o pigmento Remazol Brilliant Blue R (RBBR) de maneira bastante eficiente. Este resultado nos instigou a descobrir que substâncias o fungo produzia em meio de cultura, a partir da degradação do pigmento. Não foi fácil para Julie isolar e purificar as substâncias produzidas a partir da degradação do RBBR, pois o fungo degrada o pigmento de maneira muito eficiente. Os experimentos de degradação tiveram que ser repetidos várias vezes para que Julie pudesse obter quantidades suficientes das substâncias para sua completa identificação. Felizmente, as análises espectroscópicas realizadas na University of British Columbia, em colaboração com o Prof. Raymond J. Andersen e o Dr. David E. Williams, forneceram excelentes dados que nos permitiram identificar as substâncias formadas sem qualquer ambiguidade.

RBBR

A foto tirada por Julie mostra frascos contendo culturas de Tinctoporellus sp. CBMAI 1061 logo depois de adicionar o RBBR (azul escuro) e depois de diferentes dias de degradação do pigmento, até o décimo-segundo dia (frasco com meio mais claro, à direita).

Leiam nossos artigos e deixem seus comentários aqui. Em breve teremos mais resultados!

Leituras recentes

Duas de minhas leituras recentes que recomendo são os dois livros a seguir.

O primeiro, “Robert Robinson – Chemist Extraordinary”, por Trevor I. Williams, narra a biografia do químico Robert Robinson, um dos fundadores da química de produtos naturais moderna. A biografia é rica em detalhes, desde o início de sua carreira na Austrália, passando por suas várias etapas, inclusive seu forte vínculo à indústria química da Inglaterra. Um trecho que achei muito interessante é quando o pesquisador manifesta sua preocupação com a banalização da identificação das moléculas orgânicas utilizando-se métodos espectroscópicos. O autor do livro cita carta de Robinson a um de seus colaboradores, R. N. Chavrarti, na qual Robinson diz:

“I wonder whether chemistry would have been richer or the poorer if Baeyer had been able to put indigo into a machine and get the structure right away; we should probably know nothing about the isatins and numerous important synthetic reactions, and so on. It would have been a serious loss, and that is what will happen in the future if the disciplines of the physical methods of end-all and be-all in organic chemistry get their way.”

RRobinson

O segundo livro, muito interessante mesmo, é a auto-biografia da carreira de David A. Hopwood, um dos grandes microbiologistas/geneticistas/bioquímicos de micro-organismos, principalmente streptomicetos. A narrativa de Hopwood é rica em detalhes sobre sua vida e carreira científica, relatando e explicando inclusive vários dos conceitos fundamentais relacionados às suas descobertas.

Hopwood

Robert Robinson – Chemist Extraordinary, por Trevor I. Williams, Claredon Press, Oxford, 1990.

Streptomyces in Nature and Medicine – The Antibiotic Markers, por David A. Hopwood, Oxford University Press, 2007.