Sobre separações cromatográficas por CCD – I – solventes e eluentes

Químicos de produtos naturais trabalham durante boa parte do tempo otimizando e realizando separações cromatográficas. Porém, muitas vezes investimos um tempo considerável separando e re-separando misturas, as quais poderiam ser resolvidas levando-se em consideração alguns princípios básicos de cromatografia, como:

a) a qualidade dos solventes utilizados;

b) a qualidade das fases estacionárias utilizadas;

c) a seletividade dos solventes utilizados para preparar um eluente;

d) a seletividade da fase estacionária a ser utilizada.

Sobre solventes, podemos verificar que existem vários aspectos. O primeiro é o grau de pureza necessário, de acordo com a separação que se deseja. Obviamente, solventes a serem utilizados em cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) devem ter um grau de pureza muito maior do que solventes a serem utilizados na primeira separação cromatográfica de um extrato bruto. Mesmo assim, o teor de água em solventes polares influencia fortemente na qualidade de uma separação cromatográfica preliminar. Portanto, é desejável que solventes como metanol (MeOH), etanol (EtOH), acetona e até mesmo acetato de etila tenham um baixo teor de água. Para tanto, muitas vezes é necessário secar e destilar os solventes. Se tal procedimento for viável, a literatura (Perrin e Amarego, “Purification of Laboratory Chemicals”, Pergamon Press, 3a edição, 1988) recomenda:

MeOH e EtOH – simplesmente uma destilação cuidadosa pode diminuir o teor de água até 0,01%.

isopropanol (i-PrOH) – normalmente pouco utilizado em cromatografia de coluna (CC), i-PrOH é bastante utilizado em separações por HPLC, e não necessita de purificação se adquirido com grau de pureza cromatográfico.

acetona – pode ter quantidades variáveis de i-PrOH e água. Um bom procedimento é adicionar permanganato de potássio (KMnO4) suficiente para que a coloração roxa persista e simplesmente destilar a mistura. Se muito impura, a “cauda” da destilação se tornará apreciavelmente marrom devido à formação de MnO2.

Solventes apolares apresentam impurezas tais como ftalatos e estabilizantes (no caso de solventes clorados). Para estes, o procedimento de purificação é distinto:

hexano – pode conter quantidades apreciáveis de ftalatos e hidrocarbonetos aromáticos. Para se obter hexano de boa qualidade, idealmente deve ser tratado com uma pequena proporção (cerca de 1 – 5% do volume a ser purificado) de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4) de maneira a promover a sulfonação dos hidrocarbonetos aromáticos. Após separação do H2SO4 em funil de separação, o hexano é lavado com uma solução saturada de bicarbonato de sódio (NaHCO3), depois com água, sêco com cloreto de cálcio (CaCl2) e destilado. Desta maneira se obtém hexano com muito bom grau de pureza.

diclorometano (CH2Cl2): deve ser tratado de maneira idêntica ao hexano.

clorofórmio (CHCl3) – deve ser lavado com água para eventual remoção de EtOH (estabilizante), secagem com CaCl2, destilação e armazenamento em frascos muito escuros, longe da luz. Clorofórmio reage lentamente com oxigênio e luz fornecendo fosgênio (Cl2C=O), cloro (Cl2) e cloreto de hidrogênio (HCl), contaminantes perigosos e que podem promover a degradação de compostos orgânicos suscetíveis a ácidos.

acetato de etila (AcOEt) – as principais impurezas são água, EtOH e ácido acético (AcOH). Pode ser purificado por lavagem com solução saturada de carbonato de sódio (Na2CO3), sêco com sulfato de cálcio (CaSO4) ou sulfato de magnésio (MgSO4) e destilado.

éter etílico (Et2O) – este solvente pode conter principalmente quantidades apreciáveis de EtOH e água, mas também peróxido de dietila (Et-O-O-Et) e aldeídos. A obtenção de Et2O de boa qualidade é trabalhosa. Um litro de Et2O deve ser agitado com uma solução de 110 mL de água contendo 6 g de sulfato ferroso (FeSO4) e 6 mL de H2SO4 concentrado. Após a separação das fases, o Et2O deve ser lavado com água, seco por 24 h com CaCl2 e destilado. O solvente purifiado deve ser guardado no escuro e utilizado no máximo em alguns dias.

Outros solventes que podem ser utilizados em misturas eluentes são: tolueno (metilbenzeno), tetraidrofurano (THF), dioxano, dimetilformamida (apenas para cromatografia em camada delgada, CCD), acetonitrila (MeCN), n-butanol. Estes podem ser adquiridos com bom grau de pureza (e são caros). No caso de THF e dioxano, estes devem ser também guardados no escuro, pois, tal como Et2O, podem formar peróxidos quando guardados por períodos prolongados.

Eluentes preparados com solventes de bom grau de pureza fornecem melhores separações cromatográficas.

Eluentes utilizados para cromatografia em modo normal (fase estacionária polar – fase móvel apolar) podem apresentar composições as mais variadas, dependendo da classe de compostos que se deseja separar. Estes variam desde lipídios (muito apolares) até aminoácidos (muito polares). Usualmente se utiliza cromatografia em modo normal para análises por cromatografia em camada delgada (CCD), que podem (e devem!) ser utilizadas para se escolher o eluente mais apropriado para separações por cromatografia em coluna (CC) em modo normal. Levando-se em conta que a fase estacionária de longe mais utilizada em CCD é sílica gel, boas misturas eluentes são (por ordem de polaridade):

misturas binárias:

  1. hexano-CH2Cl2

  2. hexano-AcOEt

  3. hexano-acetona

  4. hexano-isopropanol

  5. CH2Cl2-AcOEt

  6. CH2Cl2-acetona

  7. CH2Cl2-isopropanol

  8. CH2Cl2-MeOH

  9. CH2Cl2-THF

  10. CH2Cl2-MeCN

  11. AcOEt-MeOH

  12. tolueno-acetona

  13. tolueno-AcOEt

  14. acetona-H2O

  15. EtOH-hidróxido de amônio (NH4OH)

misturas ternárias:

  1. hexano- CH2Cl2-AcOEt

  2. CH2Cl2-AcOEt-MeOH

  3. CH2Cl2-MeOH-DMF

  4. CHCl3-MeOH-AcOH (poucas gotas deste último) – para substâncias com caráter ácido

  5. n-BuOH-AcOH-H2O – idem

  6. EtOAc/MeOH/NH4OH (poucas gotas deste último) – para substâncias de caráter alcalino

misturas quaternárias:

  1. hexano- CH2Cl2-AcOEt-MeOH

  2. hexano-isopropanol-AcOEt-MeOH

Vale a pena usar a imaginação, de maneira criteriosa. A bíblia sobre cromatografia em camada delgada ainda é o livro de Egon Stahl, “Thin Layer Chromatography”, Springer-Verlag, 1969. Não conheço outro melhor.

A importância de se estudar produtos naturais

No meu entender, são MUITAS as razões para se estudar os componentes do metabolismo secundário, também chamados de produtos naturais. A seguir, listo algumas que me parecem boas. Gostaria de que outras fossem adicionadas à esta lista.

– Conhecer a ocorrência de produtos do metabolismo secundário, suas características físicas (espectroscópicas) e químicas (acidez, basicidade, reatividade).

– Devido à sua distribuição restrita em determinados grupos taxonômicos (táxons), relacionar sua ocorrência com a classificação biológica dos organismos que as produzem e/ou acumulam (quimiotaxonomia).

– Em consequência, pode-se inferir a respeito da filogenia (evolução) dos organismos, em função destes apresentarem determinados grupos de produtos naturais, relacionados entre si, o que significa de organismos que apresentam grupos de produtos naturais similares podem ser filogeneticamente (evolutivamente) relacionados. A ocorrência de determinadas substâncias em táxons bem definidos pode ajudar na determinação da história evolutiva (filogenia) do grupo, bem como a sua posição taxonômica e filogenética com relação a outros táxons.

– Conhecer a forma através da qual essas substâncias são formadas, ou a sua biossíntese. O conhecimento da biossíntese de produtos naturais permite que se estabeleça as rotas biogenéticas gerais para a sua formação, bem como os precursores, os intermediários e as enzimas que participam desse processo. Em última instância, o genoma responsável pela codificação de sua biossíntese.

– Conhecer a contribuição dessas substâncias e de sua biossíntese para a economia metabólica do organismo que a produz, a forma através da qual o organismo armazena e libera essas substâncias.

– A(s) função(ões) fisiológica(s) e ecológica(s) dessas substâncias para os organismos que as produzem, de maneira a compreender sua atuação como mediadores químicos em processos intraespecíficos (Biologia Química) ou inter-específicos (Ecologia Química).

– Conhecer o potencial de aplicação econômica dessas substâncias (produtos naturais), e sua aplicação como:

a. aditivos em alimentos: vitaminas, corantes, flavorizantes, aromatizantes e antioxidantes);

b. medicamentos;

c. agroquímicos (pesticidas, herbicidas, inseticidas);

d. venenos;

e. ferramentas bioquímicas.

f. cosméticos

– Desenvolver novos métodos para a sua detecção, análise e identificação.

– Desenvolver novas metodologias de reações orgânicas e de síntese orgânica, que permitem a transformação de grupos funcionais, formação de ligações carbono-carbono e a síntese de moléculas complexas ou estruturalmente únicas.

– Utilizar produtos naturais como base para o desenvolvimento de novos materiais.

Algo mais?

Metabolismo secundário e produtos naturais

Segundo Geissman e Crout (Organic Chemistry of Secondary Plant Metabolism, 1969), substâncias do metabolismo secundário são de natureza relativamente complexa e distribuição restrita, ao contrário das substâncias do metabolismo primário que apresentam uma distribuição universal. Poucos produtos naturais possuem uma função característica bem determinada no metabolismo dos organismos que as produzem. Contudo, também não podem ser considerados como “lixo metabólico”, “anomalias funcionais”, ou ainda produtos finais de degradação do metabolismo primário. Sua função é desconhecida pela nossa incapacidade de estabelecê-la.

Segundo Luckner (Secondary Metabolism in Plants and Animals, 1972), o metabolismo secundário é constituído por uma infinidade de substâncias que em geral são consideradas produtos de excreção, fonte de energia ou produtos de estocagem (?) sem qualquer importância para os organismos que as produzem.

Segundo Martin e Demain (in The Filamentous Fungi, 1978, vol. III), no caso de microorganismos, metabolitos secundários são os produtos do metabolismo que são quase sempre produzidos após a fase de crescimento, não apresentando função durante o crescimento, embora possam apresentar função essencial para a sobrevivência da linhagem (ex., antibióticos). São produzidos por grupos específicos de microorganismos, apresentam estruturas químicas pouco usuais, e quase sempre ocorrem na forma de misturas de compostos muito semelhantes.

Segundo Mann (Secondary Metabolism, 1980), os produtos do metabolismo secundário são substâncias pretencentes a um único organismo, ou a um pequeno grupo de organismos [geneticamente] relacionados. Na maioria das vezes, são substâncias que não são absolutamente essenciais para a manutenção da vida dos organismos que as contém, em contraste aos outros compostos de origem natural, açúcares, aminoácidos, nucleotídeos e seus respectivos polímeros, os quais são todos essenciais e ubíquos (de ampla ocorrência).

Segundo Herbert (The Biosynthesis of Secondary Metabolites, 1981), substâncias do metabolismo primário constituem as principais vias de uma linha de trem; as substâncias do metabolismo secundário constituem as ramificações dessas linhas, e aonde chegam a seu termo. Produtos do metabolismo secundário podem ser distingüidos daqueles do metabolismo primário, de acordo com as seguintes premissas:

– apresentam distribuição restrita, sendo limitadas a plantas e microorganismos, sendo ainda restritas a grupos pertencentes a um mesmo gênero, espécie ou linhagem;

– são formadas a partir das substâncias do metabolismo primário;

– não são essenciais para a manutenção da vida, sendo, porém, importantes para os organismos que as produzem. Qual é essa importância? Boa pergunta.

– são formadas a partir de um número limitado de substâncias do metabolismo primário: aminoácidos, acetil-coenzima A, ácido mevalônico, e intermediários do metabolismo do ácido shiquímico.

Segundo Manitto (Biosynthesis of Natural Products, 1981), produtos naturais são substâncias que não são essenciais para a existência dos indivíduos como tais, mas que exercem uma função fundamental para a sobrevivência da espécie. A real razão para a sua produção é desconhecida.

Segundo Torsell (Natural Products Chemistry, 1983), produtos do metabolismo secundário são característicos de um determinado grupo biológico, tal como uma determinada família ou gênero, e a forma pela qual são biossintetizados é resultado da história evolutiva do(s) organismo(s) que as produzem. Sua real função é, no mais das vezes, desconhecida. Porém, não são “lixo metabólico”, em vista do fato que vários produtos naturais são acumulados em quantidades apreciáveis pelos organismos que os produzem. Produtos naturais podem ser considerados como substância de pouco ou nenhum valor nutricional, e que controlam a biologia de outras espécies no ambiente em que se encontram. Em outras palavras, produtos naturais apresentam uma função fundamental na co-existência e na co-evolução das espécies biológicas, podendo atuar como:

– mediadores de atração sexual;

– estimulantes de consumo (feedants), ou inibidores de consumo (anti-feedants), repelentes ou toxinas;

– mecanismos de defesa e de alarme (em animais);

– mediadores químicos nos processos de desenvolvimento, metamorfose, estimuladores ou supressores de crescimento;

– mediadores em processos de interação social, agindo como agentes estimulantes de construção (cupins); marcadores territoriais (abelhas); indicadores de trilhas (formigas), etc.

Segundo Davies (in Microbiology, 1985), a definição mais simples de produtos do metabolismo secundário é que estes não se encontram nos mapas metabólicos do metabolismo primário.

Segundo Bennett e Bentley (in Advances in Applied Microbiology, 1989, 34, 1), produtos do metabolismo secundário constituem intermediários ou produtos metabólicos, quase sempre (mas nem sempre!) restritos a grupos taxonômicos específicos, sendo biossintetizados a partir de um ou mais precursores metabólicos através de uma série de reações enzimáticas.

Segundo Luckner (Secondary Metabolism in Microorganisms, Plants and Animals, 1990) a biossíntese de produtos secundários é, no mais das vezes, pouco onerosa para as células que a realizam (!!), porém essas substâncias apresentam funções essenciais no desenvolvimento e função (?) do organismo que as produz. As principais características dessas substâncias são:

– a sua distribuição taxonômica restrita;

– sua formação (biossíntese), envolvendo enzimas específicas;

– a compartimentalização (em vesículas e organelas especializadas) das enzimas, dos precursores, intermediários e produtos envolvidos na sua biossíntese;

– controle da biossíntese, através da disponibilização das enzimas responsáveis por sua realização;

– a expressão do metabolismo secundário (produção e liberação intra-celular e extra-celular) em função da fase do crescimento e do desenvolvimento do organismo produtor;

– a enorme variação estrutural de substâncias estruturalmente relacionadas;

– a pouca importância dessas substâncias para as células que as produzem, mas sendo primordiais para o organismo como um todo (?).

Segundo Vining (in Secondary Metabolites: their function and evolution, 1992), 1. No caso de microorganismos, metabolitos secundários não são essenciais para o crescimento e tendem a ser espécie-específicos; 2. Apresentam uma grande variedade estrutural e de atividades biológicas; 3. São formados através de rotas biossintéticas particulares, a partir de produtos do metabolismo primário e intermediários.

Segundo Hunter (in Trends in Biotechnology, 1992, 10, 144), no caso de microorganismos, o metabolismo secundário é constituído por rotas bioquímicas que são desnecessárias para o crescimento e reprodução, mas tas rotas são constitutivas e parte da expressão genética, fisiológica de bioquímica de um ou um grupo de organismos.

Considerando os pontos apresentados por estes autores, podemos propor uma definição geral para os produtos do metabolismo secundários (denominados ‘produtos naturais’ ou ‘metabólitos secundários’):

– São substâncias distintas dos blocos bioquímicos comuns a todos os seres vivos: açúcares, nucleosídeos, aminoácidos e seus respectivos polímeros.

– Apresentam distribuição restrita a um grupo, ou grupos, genetica e taxonomicamente relacionados.

– Exercem, em geral, atividades extra-celulares alheias às células que as produzem.

– Apresentam, via de regra, funções fisiológicas e adaptativas.

– São formadas através de rotas bioquímicas caraterísticas.

– No caso de microorganismos, exercem funções outras que relacionadas ao crescimento e desenvolvimento do microorganismo, sendo em geral produzidas após o crescimento.

Tetrodotoxina

A seguir, a estrutura da tetrodotoxina (TTX), uma de minhas favoritas. A TTX foi originalmente isolada de baiacús, peixes da família Tetraodontidae. Para quem nunca os viu, estes peixes “inflam” como um balão quando se sentem ameaçados, apresentando protuberâncias que parecem espinhos. Além disso, acumulam TTX em suas vísceras, e por vezes na sua pele. Por “inflarem”, são conhecidos em inglês por “puffer fish”. Em japonês, fugu. Os apreciadores garantem que a carne de baiacús é extremamente saborosa, porém o seu preparo requer uma limpeza extremamente cuidadosa para não contaminar a carne com TTX, a qual, em doses muito pequenas é mortal.

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A TTX foi originalmente isolada na forma bruta em 1909 por Tahara. A primeira forma pura da TTX foi obtida a partir do extrato de 60 kg de ovários do peixe Fugu rubripens por precipitação com formaldeído, acetato de chumbo, hidróxido de amônio e ácido acético. A toxina ainda impura foi cristalizada com ácido pícrico, picrato de mercúrio, fenilhidrazina e ácido picrolônico. O produto cristalino foi purificado por cromatografia em coluna de alumina, e re-cristalização em MeOH/água. Desta maneira foi possível se obter 13 mg de TTX pura. Este método foi desenvolvido em 1950 por Yokoo. Todavia, muitas outras metodologias foram posteriormente desenvolvidas, utilizando principalmente cromatografia de permeação em BIOGEL P2 (um gel de poliacrilamida), cromatografia em resinas de troca iônica e purificação por HPLC em colunas de troca iônica. Para os interessados, uma revisão histórica sobre os primeiros métodos de isolamento de TTX pode ser encontrada no livro “Advances in Natural Products Chemistry: Extraction and Isolation of Biologically Active Compounds” (editado por S. Natori, N. Ikekawa, e M. Suzuki), Wiley, New York, 1981, p. 511-524 (este livro está disponível na biblioteca do IQ-UNICAMP).

Mais fascinante do que o isolamento de um composto tão polar sem a ajuda de técnicas cromatográficas foi sua determinação estrutural, realizada sem a utilização de ressonância magnética nuclear (RMN) ou de espectrometria de massas (EM). A estrutura da TTX foi elucidada principalmente por métodos de degradação química e análises por ultravioleta e infravermelho, tendo sido confirmada por análise por difração de raios X. O mais interessante é o fato de que 4 grupos de pesquisa apresentaram, de maneira simultânea e independente, a estrutura da TTX no mesmo simpósio de produtos naturais da IUPAC, realizado em 1964 em Kyoto, no Japão: os grupos de Bob Woodward (Pure Appl. Chem., 1964, 9, 49; J. Am. Chem. Soc., 1964, 86, 5030); K. Tsuda (Chem. Pharm. Bull., 1964, 12, 642; idem, ibidem, 1964, 12, 1257), Mosher (Science, 1964, 144, 1100) e Goto (Tetrahedron, 1965, 21, 2059). Subsequentemente, mais de 20 derivados da TTX foram isolados das mais diversas fontes: salamandras, sapos, polvos, caranguejos, algas, além de muitos outros, sendo que mais recentemente se descobriu que a verdadeira origem da TTX é bacteriana. Muitas revisões foram escritas sobre a TTX. Uma particularmente interessante foi publicada por John Daly no Journal of Natural Products (2004, 67, 1211-1215). Ainda não se conhece a origem biossintética da TTX.

A atividade biológica da TTX é como bloqueadora do fluxo de íons sódio (Na+) em células nervosas, levando à morte por parada respiratória. Por isso mesmo, a TTX é amplamente utilizada como ferramenta bioquímica no estudo de processos de transmissão nervosa, e derivados fluorescentes da TTX foram utilizados para se estabelecer a estrutura tridimensional dos canais de sódio em membranas dos neurônios (Ren et al., Science, 2001, 294, 2372-2375).

A primeira síntese total (racêmica) da TTX foi realizada pelo grupo de Yoshito Kishi em 1972 (J. Am. Chem. Soc., 1972, 94, 9219-9221). Após esta síntese, a segunda síntese da TTX, já na sua forma enantiomericamente pura, foi realizada por dois grupos. A síntese de Isobe levou mais de 20 anos para ser finalizada (J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 8798-8805). Já a síntese de DuBois, menos de 3 anos (J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 11510-11511).

Esta molécula fascinante é uma das centenas de milhares que constituem a química dos organismos vivos.

Quais questões?

Segundo o psicólogo e filósofo Carl Gustav Jung, a dúvida é o cerne do crescimento pessoal.

As questões metabólicas – sobre o metabolismo dos seres vivos – são praticamente infinitas, posto que a maioria dos organismos ainda é desconhecida. Estima-se que menos de 3% de todas espécies de bactérias e 5% dos fungos da Terra são conhecidos.

Dificuldades relacionadas à descrição da biodiversidade das bactérias marinhas constituem enormes desafios a serem superados. Por exemplo, utilizando-se análises de sequências de DNA ribossômico 16S depositadas no GenBank, observou-se que espécies marinhas de bacterioplâncton correspondem a 1.117 ribotipos únicos, dos quais 609 foram atribuídos a clones ambientais não cultivados e a 508 de bactérias cultivadas (Hagström et al., 2002). Gêneros e espécies completamente novas de Actinomycetaceae marinhos foram descobertos, tal como o táxon MAR 1, de ampla ocorrência em regiões tropicais e subtropicais. O táxon MAR 1, pertencente ao clado Micromonosporaceae, é constituído por estirpes que nem sempre exigem condições estritamente salinas para crescimento. Estas linhagens foram repetidamente isoladas em coletas seqüenciais de sedimentos marinhos. Linhagens de MAR 1 são dominantes, correspondendo a ca. 90% dos Actinomycetae encontrados em sedimentos marinhos. Os novos clados MAR 2 e MAR 3, relacionados a Streptomyces spp., também foram isolados (Jensen et al., 2005). Muitas das novas cepas de MAR 2 e MAR 3 foram atribuídas a novos gêneros, como Salinispora (Maldonado et al., 2005) e Marinispora (Kwon et al., 2006; Ward e Bora, 2006).

Espécies descritas de fungos marinhos atualmente correspondem a 537; porém, o número real deve ultrapassar 10.000 espécies. É ainda necessário se investigar fungos marinhos de todos os tipos de substratos, com o objetivo de obter uma estimativa real de sua diversidade. Estes substratos incluem manguezais, de algas marinhas, animais marinhos, sedimentos e espécies encontradas em alto mar e mar profundo (Gareth Jones, 2011).

Cepas de fungos do solo parecem ser muito mais abundantes do que em qualquer outro ambiente (Schmidt et al., 2007; Schmidt et al., 2008). Considerando que aproximadamente 80.000-100.000 espécies descritas de fungos provavelmente correspondem a apenas 5% de todas as espécies (Schmidt et al., 2008), é evidente que existe uma diversidade inimaginável de cepas de fungos a serem descobertas, descritas e bioprospectadas.

Bactérias do solo também são abundantes, correspondendo a 10e9 células bacterianas por grama de solo. No entanto, estas são difíceis de cultivar em meios artificiais (Janssen, 2008). É consenso que 95% dos fungos ainda não foram cultivados, ou seja, são essencialmente desconhecidos (Demain e Sanchez, 2009; Hawksworth, 2001; Kis-Papo, 2005). Estimativas de 1,5 milhões de espécies de fungos foram propostas em 1991 (Hawksworth, 1991), atualizadas para 2,3 milhões de espécies em 2001 (Hawksworth, 2001) e revisadas até 3,0 milhões de espécies em 2012 (Hawksworth, 2012), um nível impressionante de diversidade. Outros autores sugerem 611.000 espécies de fungos na Terra, sendo 7% conhecidas (Mora et al., 2011), 712.000 de espécies de fungos totais (Schmit e Muller, 2007). No entanto, esse número de espécies parece ser subestimado (Hawksworth, 2012). Os dados da diversidade de fungos indicam que esta é maior nas regiões temperadas, embora a dimensão dessa diferença seja difícil de estabelecer. Hawksworth (2012) afirma que “a falta de estimativas abrangentes da relação fungo:planta nos trópicos continua a ser um problema, e esses estudos são vitais (…)”. Dados de sequenciamento de genomas de alto rendimento (high throughtput genome sequencing) indicam uma diversidade de fungos ainda mais impressionante, com correlação direta entre diversidade de espécies e precipitação de chuva no solo, mas não necessariamente entre espécies de fungos e diversidade de espécies de plantas (McGuire et al., 2011). Estudos realizados na floresta amazônica colombiana durante 3,5 anos levou ao isolamento de 632 espécies de fungos macroscópicos, dos quais 52% não puderam ser descritos em nível de espécie (López-Quintero et al., 2012). Outros grupos de fungos, mais específicos, são abundantes e em grande parte desconhecidos em regiões tropicais (Hawksworth, 2012). Quando ferramentas moleculares foram empregadas para investigar relação numérica fungo:planta, o número parece ser próximo de 8 para avaliações realizadas no Reino Unido e no Alasca (Howksworth, 2012). Howksworth sugere uma análise cuidadosa de fatores ambientais que podem determinar a extensão e a natureza da comunidade de fungos, e que esses números de diversidade fúngica devem ser cuidadosamente considerados dentro de um intervalo entre 1,5 e 3 milhões de espécies (Howksworth, 2012).

A diversidade das bactérias do solo também é excepcionalmente alta. Avaliação pioneira da diversidade bacteriana do solo por análise do DNA do solo obtida em Seim, Norte de Bergen, Noruega, apresentou uma diversidade de cerca de 4.000 genomas bacterianos distintos, correspondendo a uma diversidade aproximadamente 200 vezes maior do que de bactérias cultiváveis (Torsvik et al., 1990). Análises de impressão digital do DNA ribossômico da diversidade bacteriana de 96 amostras de solo coletadas na América do Norte e do Sul demonstrou que o pH do solo é o fator mais importante que influencia a diversidade bacteriana. Não foi observada correlação entre a diversidade de bactérias e plantas, ou com temperatura, gradiente latitudinal ou distância geográfica (Fierer e Jackson, 2006). Avaliação recente, utilizando-se metagenômica, demonstrou que a diversidade bacteriana do solo varia tanto vertical quanto horizontalmente, e sua avaliação é metodologicamente muito dependente. Os resultados mostram que procedimentos metagenômicos apenas fornecem resultados tendenciosos da comunidade bacteriana do solo, e que esta pode ser muito maior do que o número atualmente aceito, entre 10e4 a 10e7 espécies por grama de solo (Delmont et al., 2011) .

Apesar da diversidade de micro-organismos de solo e sua versatilidade metabólica, nos últimos anos essa diversidade microbiana tem sido negligenciada. Muita ênfase tem sido direcionada para a descoberta de novas linhagens microbianas e produtos naturais bioativos de endófitos, micro-organismos marinhos e extremófilos; a bio- e quimiodiversidade dos micro-organismos do solo foram praticamente “esquecidas” após muitos anos de prospecção bem-sucedida, particularmente de antibióticos, mas também de outros agentes quimioterapêuticos (Clardy et al., 2006). Muitos pesquisadores acreditam que a prospecção de micro-organismos de solo está “esgotada”, uma vez que o grau de redundância na descoberta de produtos naturais bioativos já conhecidos das cepas microbianas do solo é extremamente elevado. Todavia, o que é evidente é que os bioprospectores microbianos do solo é que estão esgotados, uma vez que são necessárias inovações metodológicas, esforços contínuos e dedicação para se desenvolver novos procedimentos e novas abordagens utilizando-se tecnologia de ponta, de maneira a melhor se compreender e explorar os micro-organismos terrestres como fonte de compostos bioativos (Pearce et al., 2010). Micro-organismos de solo, particularmente actinomicetos, são excelentes produtores de produtos químicos bioativos estruturalmente únicos. Estes incluem antibióticos bacterianos e fúngicos, agentes anticancerígenos, inibidores enzimáticos, imunossupressores, drogas hipocolesterolêmicas, inseticidas e agentes antiparasitários (Demain e Sanchez, 2009; Clardy et al., 2006; Singh et al., 2010 Genilloud et al., 2011).

Assim, é mais do que evidente que a maior parte do metabolismo secundário ainda é completamente desconhecida.

Referências

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Delmont, T.O., Robe, P., Cecillon, S., Clark, I.M., Constancias, F., Simonet, P., Hirsch, P.R., Vogel, T.M. (2011) Accessing the Soil Metagenome for Studies of Microbial Diversity. Appl. Environm. Microbiol., 77:1315-1324.

Demain, A.L., Sanchez, S. (2009) Microbial drug discovery: 80 years of progress. J. Antibiot., 62:5-16.

Fierer, N., Jackson, R. B. (2006) The diversity and biogeography of soil bacterial communities. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 103 626-631.

Gareth Jones, E.B. (2011) Are there more marine fungi to be described? Bot. Mar., 54:343–354.

Genilloud, O., González, I., Salazar, O., Martín, J., Tormo, J. R., Vicente, F. (2011) Current approaches to exploit actinomycetes as a source of novel natural products. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 38, 375-389.

Hagström, A., Pommier, T., Rohwer, F., Simu, K., Stolte, W., Svensson, D., Zweifel, U.L. (2002) Use of 16S Ribosomal DNA for Delineation of Marine Bacterioplankton Species. Appl. Environm. Microbiol., 68:3628-3633.

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Entrevista à Revista Pesquisa FAPESP

Entrevista concedida na semana passada sobre a descoberta e síntese de novas fomactinas, tema de nosso artigo recente na revista Nature Chemistry, foi divulgada na forma de podcast pela revista da FAPESP.

http://revistapesquisa.fapesp.br/2018/09/03/entrevista-roberto-berlinck/

Roberto Berlinck, químico do Instituto de Química de São Carlos da USP, fala sobre um estudo colaborativo que permitiu a sintetização de substâncias produzidas por um fungo marinho capazes de inibir a proliferação de células tumorais expostas a raios gama.

Apresentação: Fabrício Marques
Participação: Rodrigo de Oliveira Andrade
Produção e roteiro: Sarah Caravieri
Gravação e montagem: Dagoberto Alves (Rádio USP)

Obs: “sintetização”. Gostei.

Reveladas estruturas de metil-transferases da biossíntese de meleagrina e oxalina, produzidas por P. oxalicum

Poxalicum F30

Nosso último artigo publicado na revista Organic and Biomolecular Chemistry resulta de trabalho colaborativo com os grupos do Prof. David H. Sherman e Profa. Janet Smith da University of Michigan. O trabalho descreve as metil-transferases envolvidas nas últimas etapas da biossíntese da meleagrina e oxalina, ambas produzidas pelo fundo Penicillium oxalicum.

meleagrin-oxaline

O artigo descreve as duas metil-transferases de P. oxalicum, OxaG e OxaC, inclusive suas estruturas cristalográficas, além de peculiaridades dos sítios catalíticos observados para as enzimas. O trabalho experimental foi desenvolvido principalmente por Stelamar Romminger, ex-aluna de doutorado do QOSBio, e Sean Newmister, pesquisador de pós-doutorado do Life Sciences Institute da University of Michigan.

Não deixe de ler o artigo, aqui.

Revista FAPESP divulga nosso último artigo – Nature Chemistry

A edição de hoje da Revista Pesquisa FAPESP divulga nosso último artigo, publicado na revista Nature Chemistry.

De autoria de Rodrigo de Oliveira Andrade, o artigo traz uma apreciação do artigo da Nature Chemistry, de trabalho realizado em conjunto com o grupo do Professor Richmond Sarpong, do Departamento de Química da University of California, Berkeley, e com o grupo da Professora Sonia Jancar, do Instituto de Ciências Biomédicas da USP.

Confira o artigo de Rodrigo nesse link.

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Bolsas de Estágio BEPE aprovadas!

Recentemente as alunas de doutorado do QOSBio, Mirelle Takaki e Laura P. Ióca, foram outorgadas com Bolsa de Estágio de Pesquisa no Exterior (BEPE) da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).

O projeto de Mirelle será de adquirir conhecimento sobre técnicas de metabolômica de última geração, desenvolvidas pelo grupo do Professor Roger Linington, da Simon Fraser University, em Vancouver, Canadá. O grupo de Prof. Linington tem desenvolvido diversas ferramentas de metabolômica, bancos de dados, e estratégias ômicas, para a investigação do metabolismo de micro-organismos. O projeto de Mirelle terá como foco o estudo do metabolismo de linhagens fúngicas fitopatogênicas, objetivando entender possíveis mecanismos de fitopatogenicidade.

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Campus da Simon Fraser University em Vancouver.

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O projeto de Laura objetiva a investigação e expressão de gene clusters da bactéria Pseudovibrio brasiliensis (aka Pseudovibrio denitrificans Ab134), em particular gene clusters do tipo NRPSs. Laura deverá identificar os produtos de expressão, investigar sua biossíntese e suas atividades biológicas. O projeto será desenvolvido no grupo da Profa. Alessandra Eustáquio, do College of Pharmacy da University of Illinois em Chicago.

Foto_Laura  Alessandra-Eustaquio

Parte do campus da University of Illinois em Chicago.

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O grupo de São Carlos deseja um ano de muito sucesso no trabalho intenso de Mirelle e Laura durante seus estágio BEPE!