“As structure determination of molecules becomes increasingly routine, the role played by isolation becomes increasingly important. Modern spectroscopic methods have made it feasible to deal with minute quantities of material or very unstable compounds and, in many cases, such compounds are essential in daily maintenance of life. However, no structural studies can be carried out unless the factor is isolated in a pure state. Isolation and purification of bioactive factors are thus the first obstacles to be overcome; it frequently is the dividing point between successful or unsuccessful studies of further structured-based investigations on mode of action, and so on.” (Bruening et al., J. Nat. Prod., 1986, 49, 193-204).

“In any study in the area of natural products chemistry, isolation and purification are the mandatory first steps that one encounters and must accomplish. Unfortunately, however, this phase is often handled too casually and without the realization that success or failure of a project is often solely determined by this step.”(…) “Structure determination has nowadays become quite routine, but isolation and purification steps will never be routine.” (Nakanishi, K., in Natural Products of Woody Plants (J. W. Rowe, editor), Springer-Verlag, Berlin, 1989).

Idealmente o processo de isolamento deve ser: – rápido; – barato; – o mais eficiente possível, de maneira a se minimizar perdas das substâncias a serem isoladas; – muito eficiente na etapa de purificação.

Importância do processo de isolamento: obter a(s) substância(s) que se deseja com o maior grau de pureza. Mas… o que é pureza? Quão pura deve estar uma substância, para que possa servir ao(s) propósito(s) para o(s) qual(is) foi isolada?

Na verdade, o grau de pureza de uma substância pode ser definida como sendo uma medida da concentração de outras substâncias concomitantemente na mesma amostra.

Como pode ser medida: – HPLC, com detecção por índice de refração ou por UV em 210-220 nm; – RMN, acima de 400 MHz; – CL-EM (LC-MS) ou CG-EM (GC-MS).

Uma amostra com 100% de pureza é muito difícil de ser obtida, devido à presença de: – contaminantes de solventes (ftalatos, estabilizantes); – lipídios: muito difíceis de separar completamente; – detergentes: cuidado na limpeza da vidraria; – outros contaminantes: sais, homólogos, contra-íons.

A origem (fonte biológica) da amostra é importante. Por exemplo, plantas apresentam pigmentos, principalmente clorofilas, difíceis de serem eliminados. Macro-organismos marinhos apresentam muitos lipídios, também de difícil purificação. Já no caso de microrganismos, o difícil é eliminar alguns constituíntes do meio de cultura, principalmente sais.

Impurezas podem ser especialmente problemáticas na realização dos seguintes experimentos: – determinação estrutural (por técnicas tais como RMN e EM), se em concentração próxima à da substância de interesse; – difração de raios X, uma vez que a presença de impurezas impede a formação de cristais; – medida da rotação específica, [α]D, dicroísmo circular ou dispersão ótica rotatória, uma vez que essas medidas são dependentes da concentração; – e, principalmente, ensaios biológicos, onde contaminantes minoritários podem ser muito ativos, enquanto que a substância isolada não o é.

Exemplos:

O ent-kauran-3-oxo-16a,17-diol foi isolado a partir de plantas, e reportado simultaneamente em duas publicações. Um dos artigos apresenta o valor de [α]D –39.2 (CHCl₃); o outro, [α]D –73.1 (CHCl₃).

As axinastatinas 2, 3 e 4, bem como o stylopeptídeo, isolados da esponja Axinella cf. carteri, apresentaram atividade citotóxica em concentrações entre pM e nM. Todavia, as mesmas substâncias, obtidas após a sua síntese, mostraram ser totalmente inativas ou muito pouco ativas. Presume-se que as amostras isoladas estavam contaminadas com alguma substância minoritária muito ativa. Tal fato ocorre com certa frequência.

Logo, o isolamento de substâncias idealmente 100% puras por RMN-¹H e HPLC nem sempre garante que as amostras estão, realmente, isentas de quaisquer contaminantes.

De qualquer forma, o grau de pureza desejado deve ser o melhor possível, de maneira a se minimizar a interferência de contaminantes nos vários tipos de experimentos a serem realizados com substâncias isoladas.

Objetivo final: obter substâncias com o maior grau de pureza possível.

Químicos de produtos naturais trabalham durante boa parte do tempo otimizando e realizando separações cromatográficas. Porém, muitas vezes investimos um tempo considerável separando e re-separando misturas, as quais poderiam ser resolvidas levando-se em consideração alguns princípios básicos de cromatografia, como:

a) a qualidade dos solventes utilizados;

b) a qualidade das fases estacionárias utilizadas;

c) a seletividade dos solventes utilizados para preparar um eluente;

d) a seletividade da fase estacionária a ser utilizada.

Sobre solventes, podemos verificar que existem vários aspectos. O primeiro é o grau de pureza necessário, de acordo com a separação que se deseja. Obviamente, solventes a serem utilizados em cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) devem ter um grau de pureza muito maior do que solventes a serem utilizados na primeira separação cromatográfica de um extrato bruto. Mesmo assim, o teor de água em solventes polares influencia fortemente na qualidade de uma separação cromatográfica preliminar. Portanto, é desejável que solventes como metanol (MeOH), etanol (EtOH), acetona e até mesmo acetato de etila tenham um baixo teor de água. Para tanto, muitas vezes é necessário secar e destilar os solventes. Se tal procedimento for viável, a literatura (Perrin e Amarego, “Purification of Laboratory Chemicals”, Pergamon Press, 3a edição, 1988) recomenda:

MeOH e EtOH – simplesmente uma destilação cuidadosa pode diminuir o teor de água até 0,01%.

isopropanol (i-PrOH) – normalmente pouco utilizado em cromatografia de coluna (CC), i-PrOH é bastante utilizado em separações por HPLC, e não necessita de purificação se adquirido com grau de pureza cromatográfico.

acetona – pode ter quantidades variáveis de i-PrOH e água. Um bom procedimento é adicionar permanganato de potássio (KMnO₄) suficiente para que a coloração roxa persista e simplesmente destilar a mistura. Se muito impura, a “cauda” da destilação se tornará apreciavelmente marrom devido à formação de MnO₂.

Solventes apolares apresentam impurezas tais como ftalatos e estabilizantes (no caso de solventes clorados). Para estes, o procedimento de purificação é distinto:

hexano – pode conter quantidades apreciáveis de ftalatos e hidrocarbonetos aromáticos. Para se obter hexano de boa qualidade, idealmente deve ser tratado com uma pequena proporção (cerca de 1 – 5% do volume a ser purificado) de ácido sulfúrico concentrado (H₂SO₄) de maneira a promover a sulfonação dos hidrocarbonetos aromáticos. Após separação do H₂SO₄ em funil de separação, o hexano é lavado com uma solução saturada de bicarbonato de sódio (NaHCO₃), depois com água, sêco com cloreto de cálcio (CaCl₂) e destilado. Desta maneira se obtém hexano com muito bom grau de pureza.

diclorometano (CH₂Cl₂): deve ser tratado de maneira idêntica ao hexano.

clorofórmio (CHCl₃) – deve ser lavado com água para eventual remoção de EtOH (estabilizante), secagem com CaCl₂, destilação e armazenamento em frascos muito escuros, longe da luz. Clorofórmio reage lentamente com oxigênio e luz fornecendo fosgênio (Cl₂C=O), cloro (Cl₂) e cloreto de hidrogênio (HCl), contaminantes perigosos e que podem promover a degradação de compostos orgânicos suscetíveis a ácidos.

acetato de etila (AcOEt) – as principais impurezas são água, EtOH e ácido acético (AcOH). Pode ser purificado por lavagem com solução saturada de carbonato de sódio (Na₂CO₃), sêco com sulfato de cálcio (CaSO₄) ou sulfato de magnésio (MgSO₄) e destilado.

éter etílico (Et₂O) – este solvente pode conter principalmente quantidades apreciáveis de EtOH e água, mas também peróxido de dietila (Et-O-O-Et) e aldeídos. A obtenção de Et₂O de boa qualidade é trabalhosa. Um litro de Et₂O deve ser agitado com uma solução de 110 mL de água contendo 6 g de sulfato ferroso (FeSO₄) e 6 mL de H₂SO₄ concentrado. Após a separação das fases, o Et₂O deve ser lavado com água, seco por 24 h com CaCl₂ e destilado. O solvente purifiado deve ser guardado no escuro e utilizado no máximo em alguns dias.

Outros solventes que podem ser utilizados em misturas eluentes são: tolueno (metilbenzeno), tetraidrofurano (THF), dioxano, dimetilformamida (apenas para cromatografia em camada delgada, CCD), acetonitrila (MeCN), n-butanol. Estes podem ser adquiridos com bom grau de pureza (e são caros). No caso de THF e dioxano, estes devem ser também guardados no escuro, pois, tal como Et₂O, podem formar peróxidos quando guardados por períodos prolongados.

Eluentes preparados com solventes de bom grau de pureza fornecem melhores separações cromatográficas.

Eluentes utilizados para cromatografia em modo normal (fase estacionária polar – fase móvel apolar) podem apresentar composições as mais variadas, dependendo da classe de compostos que se deseja separar. Estes variam desde lipídios (muito apolares) até aminoácidos (muito polares). Usualmente se utiliza cromatografia em modo normal para análises por cromatografia em camada delgada (CCD), que podem (e devem!) ser utilizadas para se escolher o eluente mais apropriado para separações por cromatografia em coluna (CC) em modo normal. Levando-se em conta que a fase estacionária de longe mais utilizada em CCD é sílica gel, boas misturas eluentes são (por ordem de polaridade):

misturas binárias:

1. hexano-CH₂Cl₂

2. hexano-AcOEt

3. hexano-acetona

4. hexano-isopropanol

5. CH₂Cl₂-AcOEt

6. CH₂Cl₂-acetona

7. CH₂Cl₂-isopropanol

8. CH₂Cl₂-MeOH

9. CH₂Cl₂-THF

10. CH₂Cl₂-MeCN

11. AcOEt-MeOH

12. tolueno-acetona

13. tolueno-AcOEt

14. acetona-H₂O

15. EtOH-hidróxido de amônio (NH₄OH)

misturas ternárias:

1. hexano- CH₂Cl₂-AcOEt

2. CH₂Cl₂-AcOEt-MeOH

3. CH₂Cl₂-MeOH-DMF

4. CHCl₃-MeOH-AcOH (poucas gotas deste último) – para substâncias com caráter ácido

5. n-BuOH-AcOH-H₂O – idem

6. EtOAc/MeOH/NH₄OH (poucas gotas deste último) – para substâncias de caráter alcalino

misturas quaternárias:

1. hexano- CH₂Cl₂-AcOEt-MeOH

2. hexano-isopropanol-AcOEt-MeOH

Vale a pena usar a imaginação, de maneira criteriosa. A bíblia sobre cromatografia em camada delgada ainda é o livro de Egon Stahl, “Thin Layer Chromatography”, Springer-Verlag, 1969. Não conheço outro melhor.

Segundo Geissman e Crout (Organic Chemistry of Secondary Plant Metabolism, 1969), substâncias do metabolismo secundário são de natureza relativamente complexa e distribuição restrita, ao contrário das substâncias do metabolismo primário que apresentam uma distribuição universal. Poucos produtos naturais possuem uma função característica bem determinada no metabolismo dos organismos que as produzem. Contudo, também não podem ser considerados como “lixo metabólico”, “anomalias funcionais”, ou ainda produtos finais de degradação do metabolismo primário. Sua função é desconhecida pela nossa incapacidade de estabelecê-la.

Segundo Luckner (Secondary Metabolism in Plants and Animals, 1972), o metabolismo secundário é constituído por uma infinidade de substâncias que em geral são consideradas produtos de excreção, fonte de energia ou produtos de estocagem (?) sem qualquer importância para os organismos que as produzem.

Segundo Martin e Demain (in The Filamentous Fungi, 1978, vol. III), no caso de microorganismos, metabolitos secundários são os produtos do metabolismo que são quase sempre produzidos após a fase de crescimento, não apresentando função durante o crescimento, embora possam apresentar função essencial para a sobrevivência da linhagem (ex., antibióticos). São produzidos por grupos específicos de microorganismos, apresentam estruturas químicas pouco usuais, e quase sempre ocorrem na forma de misturas de compostos muito semelhantes.

Segundo Mann (Secondary Metabolism, 1980), os produtos do metabolismo secundário são substâncias pretencentes a um único organismo, ou a um pequeno grupo de organismos [geneticamente] relacionados. Na maioria das vezes, são substâncias que não são absolutamente essenciais para a manutenção da vida dos organismos que as contém, em contraste aos outros compostos de origem natural, açúcares, aminoácidos, nucleotídeos e seus respectivos polímeros, os quais são todos essenciais e ubíquos (de ampla ocorrência).

Segundo Herbert (The Biosynthesis of Secondary Metabolites, 1981), substâncias do metabolismo primário constituem as principais vias de uma linha de trem; as substâncias do metabolismo secundário constituem as ramificações dessas linhas, e aonde chegam a seu termo. Produtos do metabolismo secundário podem ser distingüidos daqueles do metabolismo primário, de acordo com as seguintes premissas:

– apresentam distribuição restrita, sendo limitadas a plantas e microorganismos, sendo ainda restritas a grupos pertencentes a um mesmo gênero, espécie ou linhagem;

– são formadas a partir das substâncias do metabolismo primário;

– não são essenciais para a manutenção da vida, sendo, porém, importantes para os organismos que as produzem. Qual é essa importância? Boa pergunta.

– são formadas a partir de um número limitado de substâncias do metabolismo primário: aminoácidos, acetil-coenzima A, ácido mevalônico, e intermediários do metabolismo do ácido shiquímico.

Segundo Manitto (Biosynthesis of Natural Products, 1981), produtos naturais são substâncias que não são essenciais para a existência dos indivíduos como tais, mas que exercem uma função fundamental para a sobrevivência da espécie. A real razão para a sua produção é desconhecida.

Segundo Torsell (Natural Products Chemistry, 1983), produtos do metabolismo secundário são característicos de um determinado grupo biológico, tal como uma determinada família ou gênero, e a forma pela qual são biossintetizados é resultado da história evolutiva do(s) organismo(s) que as produzem. Sua real função é, no mais das vezes, desconhecida. Porém, não são “lixo metabólico”, em vista do fato que vários produtos naturais são acumulados em quantidades apreciáveis pelos organismos que os produzem. Produtos naturais podem ser considerados como substância de pouco ou nenhum valor nutricional, e que controlam a biologia de outras espécies no ambiente em que se encontram. Em outras palavras, produtos naturais apresentam uma função fundamental na co-existência e na co-evolução das espécies biológicas, podendo atuar como:

– mediadores de atração sexual;

– estimulantes de consumo (feedants), ou inibidores de consumo (anti-feedants), repelentes ou toxinas;

– mecanismos de defesa e de alarme (em animais);

– mediadores químicos nos processos de desenvolvimento, metamorfose, estimuladores ou supressores de crescimento;

– mediadores em processos de interação social, agindo como agentes estimulantes de construção (cupins); marcadores territoriais (abelhas); indicadores de trilhas (formigas), etc.

Segundo Davies (in Microbiology, 1985), a definição mais simples de produtos do metabolismo secundário é que estes não se encontram nos mapas metabólicos do metabolismo primário.

Segundo Bennett e Bentley (in Advances in Applied Microbiology, 1989, 34, 1), produtos do metabolismo secundário constituem intermediários ou produtos metabólicos, quase sempre (mas nem sempre!) restritos a grupos taxonômicos específicos, sendo biossintetizados a partir de um ou mais precursores metabólicos através de uma série de reações enzimáticas.

Segundo Luckner (Secondary Metabolism in Microorganisms, Plants and Animals, 1990) a biossíntese de produtos secundários é, no mais das vezes, pouco onerosa para as células que a realizam (!!), porém essas substâncias apresentam funções essenciais no desenvolvimento e função (?) do organismo que as produz. As principais características dessas substâncias são:

– a sua distribuição taxonômica restrita;

– sua formação (biossíntese), envolvendo enzimas específicas;

– a compartimentalização (em vesículas e organelas especializadas) das enzimas, dos precursores, intermediários e produtos envolvidos na sua biossíntese;

– controle da biossíntese, através da disponibilização das enzimas responsáveis por sua realização;

– a expressão do metabolismo secundário (produção e liberação intra-celular e extra-celular) em função da fase do crescimento e do desenvolvimento do organismo produtor;

– a enorme variação estrutural de substâncias estruturalmente relacionadas;

– a pouca importância dessas substâncias para as células que as produzem, mas sendo primordiais para o organismo como um todo (?).

Segundo Vining (in Secondary Metabolites: their function and evolution, 1992), 1. No caso de microorganismos, metabolitos secundários não são essenciais para o crescimento e tendem a ser espécie-específicos; 2. Apresentam uma grande variedade estrutural e de atividades biológicas; 3. São formados através de rotas biossintéticas particulares, a partir de produtos do metabolismo primário e intermediários.

Segundo Hunter (in Trends in Biotechnology, 1992, 10, 144), no caso de microorganismos, o metabolismo secundário é constituído por rotas bioquímicas que são desnecessárias para o crescimento e reprodução, mas tas rotas são constitutivas e parte da expressão genética, fisiológica de bioquímica de um ou um grupo de organismos.

Considerando os pontos apresentados por estes autores, podemos propor uma definição geral para os produtos do metabolismo secundários (denominados ‘produtos naturais’ ou ‘metabólitos secundários’):

– São substâncias distintas dos blocos bioquímicos comuns a todos os seres vivos: açúcares, nucleosídeos, aminoácidos e seus respectivos polímeros.

– Apresentam distribuição restrita a um grupo, ou grupos, genetica e taxonomicamente relacionados.

– Exercem, em geral, atividades extra-celulares alheias às células que as produzem.

– Apresentam, via de regra, funções fisiológicas e adaptativas.

– São formadas através de rotas bioquímicas caraterísticas.

– No caso de microorganismos, exercem funções outras que relacionadas ao crescimento e desenvolvimento do microorganismo, sendo em geral produzidas após o crescimento.