Purificação e isolamento
“As structure determination of molecules becomes increasingly routine, the role played by isolation becomes increasingly important. Modern spectroscopic methods have made it feasible to deal with minute quantities of material or very unstable compounds and, in many cases, such compounds are essential in daily maintenance of life. However, no structural studies can be carried out unless the factor is isolated in a pure state. Isolation and purification of bioactive factors are thus the first obstacles to be overcome; it frequently is the dividing point between successful or unsuccessful studies of further structured-based investigations on mode of action, and so on.” (Bruening et al., J. Nat. Prod., 1986, 49, 193-204).
“In any study in the area of natural products chemistry, isolation and purification are the mandatory first steps that one encounters and must accomplish. Unfortunately, however, this phase is often handled too casually and without the realization that success or failure of a project is often solely determined by this step.”(…) “Structure determination has nowadays become quite routine, but isolation and purification steps will never be routine.” (Nakanishi, K., in Natural Products of Woody Plants (J. W. Rowe, editor), Springer-Verlag, Berlin, 1989).
Idealmente o processo de isolamento deve ser: – rápido; – barato; – o mais eficiente possível, de maneira a se minimizar perdas das substâncias a serem isoladas; – muito eficiente na etapa de purificação.
Importância do processo de isolamento: obter a(s) substância(s) que se deseja com o maior grau de pureza. Mas… o que é pureza? Quão pura deve estar uma substância, para que possa servir ao(s) propósito(s) para o(s) qual(is) foi isolada?
Na verdade, o grau de pureza de uma substância pode ser definida como sendo uma medida da concentração de outras substâncias concomitantemente na mesma amostra.
Como pode ser medida: – HPLC, com detecção por índice de refração ou por UV em 210-220 nm; – RMN, acima de 400 MHz; – CL-EM (LC-MS) ou CG-EM (GC-MS).
Uma amostra com 100% de pureza é muito difícil de ser obtida, devido à presença de: – contaminantes de solventes (ftalatos, estabilizantes); – lipídios: muito difíceis de separar completamente; – detergentes: cuidado na limpeza da vidraria; – outros contaminantes: sais, homólogos, contra-íons.
A origem (fonte biológica) da amostra é importante. Por exemplo, plantas apresentam pigmentos, principalmente clorofilas, difíceis de serem eliminados. Macro-organismos marinhos apresentam muitos lipídios, também de difícil purificação. Já no caso de microrganismos, o difícil é eliminar alguns constituíntes do meio de cultura, principalmente sais.
Impurezas podem ser especialmente problemáticas na realização dos seguintes experimentos: – determinação estrutural (por técnicas tais como RMN e EM), se em concentração próxima à da substância de interesse; – difração de raios X, uma vez que a presença de impurezas impede a formação de cristais; – medida da rotação específica, [α]D, dicroísmo circular ou dispersão ótica rotatória, uma vez que essas medidas são dependentes da concentração; – e, principalmente, ensaios biológicos, onde contaminantes minoritários podem ser muito ativos, enquanto que a substância isolada não o é.
Exemplos:
O ent-kauran-3-oxo-16a,17-diol foi isolado a partir de plantas, e reportado simultaneamente em duas publicações. Um dos artigos apresenta o valor de [α]D –39.2 (CHCl3); o outro, [α]D –73.1 (CHCl3).
As axinastatinas 2, 3 e 4, bem como o stylopeptídeo, isolados da esponja Axinella cf. carteri, apresentaram atividade citotóxica em concentrações entre pM e nM. Todavia, as mesmas substâncias, obtidas após a sua síntese, mostraram ser totalmente inativas ou muito pouco ativas. Presume-se que as amostras isoladas estavam contaminadas com alguma substância minoritária muito ativa. Tal fato ocorre com certa frequência.
Logo, o isolamento de substâncias idealmente 100% puras por RMN-1H e HPLC nem sempre garante que as amostras estão, realmente, isentas de quaisquer contaminantes.
De qualquer forma, o grau de pureza desejado deve ser o melhor possível, de maneira a se minimizar a interferência de contaminantes nos vários tipos de experimentos a serem realizados com substâncias isoladas.
Objetivo final: obter substâncias com o maior grau de pureza possível.