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Metabolismo secundário e produtos naturais
Segundo Geissman e Crout (Organic Chemistry of Secondary Plant Metabolism, 1969), substâncias do metabolismo secundário são de natureza relativamente complexa e distribuição restrita, ao contrário das substâncias do metabolismo primário que apresentam uma distribuição universal. Poucos produtos naturais possuem uma função característica bem determinada no metabolismo dos organismos que as produzem. Contudo, também não podem ser considerados como “lixo metabólico”, “anomalias funcionais”, ou ainda produtos finais de degradação do metabolismo primário. Sua função é desconhecida pela nossa incapacidade de estabelecê-la.
Segundo Luckner (Secondary Metabolism in Plants and Animals, 1972), o metabolismo secundário é constituído por uma infinidade de substâncias que em geral são consideradas produtos de excreção, fonte de energia ou produtos de estocagem (?) sem qualquer importância para os organismos que as produzem.
Segundo Martin e Demain (in The Filamentous Fungi, 1978, vol. III), no caso de microorganismos, metabolitos secundários são os produtos do metabolismo que são quase sempre produzidos após a fase de crescimento, não apresentando função durante o crescimento, embora possam apresentar função essencial para a sobrevivência da linhagem (ex., antibióticos). São produzidos por grupos específicos de microorganismos, apresentam estruturas químicas pouco usuais, e quase sempre ocorrem na forma de misturas de compostos muito semelhantes.
Segundo Mann (Secondary Metabolism, 1980), os produtos do metabolismo secundário são substâncias pretencentes a um único organismo, ou a um pequeno grupo de organismos [geneticamente] relacionados. Na maioria das vezes, são substâncias que não são absolutamente essenciais para a manutenção da vida dos organismos que as contém, em contraste aos outros compostos de origem natural, açúcares, aminoácidos, nucleotídeos e seus respectivos polímeros, os quais são todos essenciais e ubíquos (de ampla ocorrência).
Segundo Herbert (The Biosynthesis of Secondary Metabolites, 1981), substâncias do metabolismo primário constituem as principais vias de uma linha de trem; as substâncias do metabolismo secundário constituem as ramificações dessas linhas, e aonde chegam a seu termo. Produtos do metabolismo secundário podem ser distingüidos daqueles do metabolismo primário, de acordo com as seguintes premissas:
– apresentam distribuição restrita, sendo limitadas a plantas e microorganismos, sendo ainda restritas a grupos pertencentes a um mesmo gênero, espécie ou linhagem;
– são formadas a partir das substâncias do metabolismo primário;
– não são essenciais para a manutenção da vida, sendo, porém, importantes para os organismos que as produzem. Qual é essa importância? Boa pergunta.
– são formadas a partir de um número limitado de substâncias do metabolismo primário: aminoácidos, acetil-coenzima A, ácido mevalônico, e intermediários do metabolismo do ácido shiquímico.
Segundo Manitto (Biosynthesis of Natural Products, 1981), produtos naturais são substâncias que não são essenciais para a existência dos indivíduos como tais, mas que exercem uma função fundamental para a sobrevivência da espécie. A real razão para a sua produção é desconhecida.
Segundo Torsell (Natural Products Chemistry, 1983), produtos do metabolismo secundário são característicos de um determinado grupo biológico, tal como uma determinada família ou gênero, e a forma pela qual são biossintetizados é resultado da história evolutiva do(s) organismo(s) que as produzem. Sua real função é, no mais das vezes, desconhecida. Porém, não são “lixo metabólico”, em vista do fato que vários produtos naturais são acumulados em quantidades apreciáveis pelos organismos que os produzem. Produtos naturais podem ser considerados como substância de pouco ou nenhum valor nutricional, e que controlam a biologia de outras espécies no ambiente em que se encontram. Em outras palavras, produtos naturais apresentam uma função fundamental na co-existência e na co-evolução das espécies biológicas, podendo atuar como:
– mediadores de atração sexual;
– estimulantes de consumo (feedants), ou inibidores de consumo (anti-feedants), repelentes ou toxinas;
– mecanismos de defesa e de alarme (em animais);
– mediadores químicos nos processos de desenvolvimento, metamorfose, estimuladores ou supressores de crescimento;
– mediadores em processos de interação social, agindo como agentes estimulantes de construção (cupins); marcadores territoriais (abelhas); indicadores de trilhas (formigas), etc.
Segundo Davies (in Microbiology, 1985), a definição mais simples de produtos do metabolismo secundário é que estes não se encontram nos mapas metabólicos do metabolismo primário.
Segundo Bennett e Bentley (in Advances in Applied Microbiology, 1989, 34, 1), produtos do metabolismo secundário constituem intermediários ou produtos metabólicos, quase sempre (mas nem sempre!) restritos a grupos taxonômicos específicos, sendo biossintetizados a partir de um ou mais precursores metabólicos através de uma série de reações enzimáticas.
Segundo Luckner (Secondary Metabolism in Microorganisms, Plants and Animals, 1990) a biossíntese de produtos secundários é, no mais das vezes, pouco onerosa para as células que a realizam (!!), porém essas substâncias apresentam funções essenciais no desenvolvimento e função (?) do organismo que as produz. As principais características dessas substâncias são:
– a sua distribuição taxonômica restrita;
– sua formação (biossíntese), envolvendo enzimas específicas;
– a compartimentalização (em vesículas e organelas especializadas) das enzimas, dos precursores, intermediários e produtos envolvidos na sua biossíntese;
– controle da biossíntese, através da disponibilização das enzimas responsáveis por sua realização;
– a expressão do metabolismo secundário (produção e liberação intra-celular e extra-celular) em função da fase do crescimento e do desenvolvimento do organismo produtor;
– a enorme variação estrutural de substâncias estruturalmente relacionadas;
– a pouca importância dessas substâncias para as células que as produzem, mas sendo primordiais para o organismo como um todo (?).
Segundo Vining (in Secondary Metabolites: their function and evolution, 1992), 1. No caso de microorganismos, metabolitos secundários não são essenciais para o crescimento e tendem a ser espécie-específicos; 2. Apresentam uma grande variedade estrutural e de atividades biológicas; 3. São formados através de rotas biossintéticas particulares, a partir de produtos do metabolismo primário e intermediários.
Segundo Hunter (in Trends in Biotechnology, 1992, 10, 144), no caso de microorganismos, o metabolismo secundário é constituído por rotas bioquímicas que são desnecessárias para o crescimento e reprodução, mas tas rotas são constitutivas e parte da expressão genética, fisiológica de bioquímica de um ou um grupo de organismos.
Considerando os pontos apresentados por estes autores, podemos propor uma definição geral para os produtos do metabolismo secundários (denominados ‘produtos naturais’ ou ‘metabólitos secundários’):
– São substâncias distintas dos blocos bioquímicos comuns a todos os seres vivos: açúcares, nucleosídeos, aminoácidos e seus respectivos polímeros.
– Apresentam distribuição restrita a um grupo, ou grupos, genetica e taxonomicamente relacionados.
– Exercem, em geral, atividades extra-celulares alheias às células que as produzem.
– Apresentam, via de regra, funções fisiológicas e adaptativas.
– São formadas através de rotas bioquímicas caraterísticas.
– No caso de microorganismos, exercem funções outras que relacionadas ao crescimento e desenvolvimento do microorganismo, sendo em geral produzidas após o crescimento.
Tetrodotoxina
A seguir, a estrutura da tetrodotoxina (TTX), uma de minhas favoritas. A TTX foi originalmente isolada de baiacús, peixes da família Tetraodontidae. Para quem nunca os viu, estes peixes “inflam” como um balão quando se sentem ameaçados, apresentando protuberâncias que parecem espinhos. Além disso, acumulam TTX em suas vísceras, e por vezes na sua pele. Por “inflarem”, são conhecidos em inglês por “puffer fish”. Em japonês, fugu. Os apreciadores garantem que a carne de baiacús é extremamente saborosa, porém o seu preparo requer uma limpeza extremamente cuidadosa para não contaminar a carne com TTX, a qual, em doses muito pequenas é mortal.
A TTX foi originalmente isolada na forma bruta em 1909 por Tahara. A primeira forma pura da TTX foi obtida a partir do extrato de 60 kg de ovários do peixe Fugu rubripens por precipitação com formaldeído, acetato de chumbo, hidróxido de amônio e ácido acético. A toxina ainda impura foi cristalizada com ácido pícrico, picrato de mercúrio, fenilhidrazina e ácido picrolônico. O produto cristalino foi purificado por cromatografia em coluna de alumina, e re-cristalização em MeOH/água. Desta maneira foi possível se obter 13 mg de TTX pura. Este método foi desenvolvido em 1950 por Yokoo. Todavia, muitas outras metodologias foram posteriormente desenvolvidas, utilizando principalmente cromatografia de permeação em BIOGEL P2 (um gel de poliacrilamida), cromatografia em resinas de troca iônica e purificação por HPLC em colunas de troca iônica. Para os interessados, uma revisão histórica sobre os primeiros métodos de isolamento de TTX pode ser encontrada no livro “Advances in Natural Products Chemistry: Extraction and Isolation of Biologically Active Compounds” (editado por S. Natori, N. Ikekawa, e M. Suzuki), Wiley, New York, 1981, p. 511-524 (este livro está disponível na biblioteca do IQ-UNICAMP).
Mais fascinante do que o isolamento de um composto tão polar sem a ajuda de técnicas cromatográficas foi sua determinação estrutural, realizada sem a utilização de ressonância magnética nuclear (RMN) ou de espectrometria de massas (EM). A estrutura da TTX foi elucidada principalmente por métodos de degradação química e análises por ultravioleta e infravermelho, tendo sido confirmada por análise por difração de raios X. O mais interessante é o fato de que 4 grupos de pesquisa apresentaram, de maneira simultânea e independente, a estrutura da TTX no mesmo simpósio de produtos naturais da IUPAC, realizado em 1964 em Kyoto, no Japão: os grupos de Bob Woodward (Pure Appl. Chem., 1964, 9, 49; J. Am. Chem. Soc., 1964, 86, 5030); K. Tsuda (Chem. Pharm. Bull., 1964, 12, 642; idem, ibidem, 1964, 12, 1257), Mosher (Science, 1964, 144, 1100) e Goto (Tetrahedron, 1965, 21, 2059). Subsequentemente, mais de 20 derivados da TTX foram isolados das mais diversas fontes: salamandras, sapos, polvos, caranguejos, algas, além de muitos outros, sendo que mais recentemente se descobriu que a verdadeira origem da TTX é bacteriana. Muitas revisões foram escritas sobre a TTX. Uma particularmente interessante foi publicada por John Daly no Journal of Natural Products (2004, 67, 1211-1215). Ainda não se conhece a origem biossintética da TTX.
A atividade biológica da TTX é como bloqueadora do fluxo de íons sódio (Na+) em células nervosas, levando à morte por parada respiratória. Por isso mesmo, a TTX é amplamente utilizada como ferramenta bioquímica no estudo de processos de transmissão nervosa, e derivados fluorescentes da TTX foram utilizados para se estabelecer a estrutura tridimensional dos canais de sódio em membranas dos neurônios (Ren et al., Science, 2001, 294, 2372-2375).
A primeira síntese total (racêmica) da TTX foi realizada pelo grupo de Yoshito Kishi em 1972 (J. Am. Chem. Soc., 1972, 94, 9219-9221). Após esta síntese, a segunda síntese da TTX, já na sua forma enantiomericamente pura, foi realizada por dois grupos. A síntese de Isobe levou mais de 20 anos para ser finalizada (J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 8798-8805). Já a síntese de DuBois, menos de 3 anos (J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 11510-11511).
Esta molécula fascinante é uma das centenas de milhares que constituem a química dos organismos vivos.
Quais questões?
Segundo o psicólogo e filósofo Carl Gustav Jung, a dúvida é o cerne do crescimento pessoal.
As questões metabólicas – sobre o metabolismo dos seres vivos – são praticamente infinitas, posto que a maioria dos organismos ainda é desconhecida. Estima-se que menos de 3% de todas espécies de bactérias e 5% dos fungos da Terra são conhecidos.
Dificuldades relacionadas à descrição da biodiversidade das bactérias marinhas constituem enormes desafios a serem superados. Por exemplo, utilizando-se análises de sequências de DNA ribossômico 16S depositadas no GenBank, observou-se que espécies marinhas de bacterioplâncton correspondem a 1.117 ribotipos únicos, dos quais 609 foram atribuídos a clones ambientais não cultivados e a 508 de bactérias cultivadas (Hagström et al., 2002). Gêneros e espécies completamente novas de Actinomycetaceae marinhos foram descobertos, tal como o táxon MAR 1, de ampla ocorrência em regiões tropicais e subtropicais. O táxon MAR 1, pertencente ao clado Micromonosporaceae, é constituído por estirpes que nem sempre exigem condições estritamente salinas para crescimento. Estas linhagens foram repetidamente isoladas em coletas seqüenciais de sedimentos marinhos. Linhagens de MAR 1 são dominantes, correspondendo a ca. 90% dos Actinomycetae encontrados em sedimentos marinhos. Os novos clados MAR 2 e MAR 3, relacionados a Streptomyces spp., também foram isolados (Jensen et al., 2005). Muitas das novas cepas de MAR 2 e MAR 3 foram atribuídas a novos gêneros, como Salinispora (Maldonado et al., 2005) e Marinispora (Kwon et al., 2006; Ward e Bora, 2006).
Espécies descritas de fungos marinhos atualmente correspondem a 537; porém, o número real deve ultrapassar 10.000 espécies. É ainda necessário se investigar fungos marinhos de todos os tipos de substratos, com o objetivo de obter uma estimativa real de sua diversidade. Estes substratos incluem manguezais, de algas marinhas, animais marinhos, sedimentos e espécies encontradas em alto mar e mar profundo (Gareth Jones, 2011).
Cepas de fungos do solo parecem ser muito mais abundantes do que em qualquer outro ambiente (Schmidt et al., 2007; Schmidt et al., 2008). Considerando que aproximadamente 80.000-100.000 espécies descritas de fungos provavelmente correspondem a apenas 5% de todas as espécies (Schmidt et al., 2008), é evidente que existe uma diversidade inimaginável de cepas de fungos a serem descobertas, descritas e bioprospectadas.
Bactérias do solo também são abundantes, correspondendo a 10e9 células bacterianas por grama de solo. No entanto, estas são difíceis de cultivar em meios artificiais (Janssen, 2008). É consenso que 95% dos fungos ainda não foram cultivados, ou seja, são essencialmente desconhecidos (Demain e Sanchez, 2009; Hawksworth, 2001; Kis-Papo, 2005). Estimativas de 1,5 milhões de espécies de fungos foram propostas em 1991 (Hawksworth, 1991), atualizadas para 2,3 milhões de espécies em 2001 (Hawksworth, 2001) e revisadas até 3,0 milhões de espécies em 2012 (Hawksworth, 2012), um nível impressionante de diversidade. Outros autores sugerem 611.000 espécies de fungos na Terra, sendo 7% conhecidas (Mora et al., 2011), 712.000 de espécies de fungos totais (Schmit e Muller, 2007). No entanto, esse número de espécies parece ser subestimado (Hawksworth, 2012). Os dados da diversidade de fungos indicam que esta é maior nas regiões temperadas, embora a dimensão dessa diferença seja difícil de estabelecer. Hawksworth (2012) afirma que “a falta de estimativas abrangentes da relação fungo:planta nos trópicos continua a ser um problema, e esses estudos são vitais (…)”. Dados de sequenciamento de genomas de alto rendimento (high throughtput genome sequencing) indicam uma diversidade de fungos ainda mais impressionante, com correlação direta entre diversidade de espécies e precipitação de chuva no solo, mas não necessariamente entre espécies de fungos e diversidade de espécies de plantas (McGuire et al., 2011). Estudos realizados na floresta amazônica colombiana durante 3,5 anos levou ao isolamento de 632 espécies de fungos macroscópicos, dos quais 52% não puderam ser descritos em nível de espécie (López-Quintero et al., 2012). Outros grupos de fungos, mais específicos, são abundantes e em grande parte desconhecidos em regiões tropicais (Hawksworth, 2012). Quando ferramentas moleculares foram empregadas para investigar relação numérica fungo:planta, o número parece ser próximo de 8 para avaliações realizadas no Reino Unido e no Alasca (Howksworth, 2012). Howksworth sugere uma análise cuidadosa de fatores ambientais que podem determinar a extensão e a natureza da comunidade de fungos, e que esses números de diversidade fúngica devem ser cuidadosamente considerados dentro de um intervalo entre 1,5 e 3 milhões de espécies (Howksworth, 2012).
A diversidade das bactérias do solo também é excepcionalmente alta. Avaliação pioneira da diversidade bacteriana do solo por análise do DNA do solo obtida em Seim, Norte de Bergen, Noruega, apresentou uma diversidade de cerca de 4.000 genomas bacterianos distintos, correspondendo a uma diversidade aproximadamente 200 vezes maior do que de bactérias cultiváveis (Torsvik et al., 1990). Análises de impressão digital do DNA ribossômico da diversidade bacteriana de 96 amostras de solo coletadas na América do Norte e do Sul demonstrou que o pH do solo é o fator mais importante que influencia a diversidade bacteriana. Não foi observada correlação entre a diversidade de bactérias e plantas, ou com temperatura, gradiente latitudinal ou distância geográfica (Fierer e Jackson, 2006). Avaliação recente, utilizando-se metagenômica, demonstrou que a diversidade bacteriana do solo varia tanto vertical quanto horizontalmente, e sua avaliação é metodologicamente muito dependente. Os resultados mostram que procedimentos metagenômicos apenas fornecem resultados tendenciosos da comunidade bacteriana do solo, e que esta pode ser muito maior do que o número atualmente aceito, entre 10e4 a 10e7 espécies por grama de solo (Delmont et al., 2011) .
Apesar da diversidade de micro-organismos de solo e sua versatilidade metabólica, nos últimos anos essa diversidade microbiana tem sido negligenciada. Muita ênfase tem sido direcionada para a descoberta de novas linhagens microbianas e produtos naturais bioativos de endófitos, micro-organismos marinhos e extremófilos; a bio- e quimiodiversidade dos micro-organismos do solo foram praticamente “esquecidas” após muitos anos de prospecção bem-sucedida, particularmente de antibióticos, mas também de outros agentes quimioterapêuticos (Clardy et al., 2006). Muitos pesquisadores acreditam que a prospecção de micro-organismos de solo está “esgotada”, uma vez que o grau de redundância na descoberta de produtos naturais bioativos já conhecidos das cepas microbianas do solo é extremamente elevado. Todavia, o que é evidente é que os bioprospectores microbianos do solo é que estão esgotados, uma vez que são necessárias inovações metodológicas, esforços contínuos e dedicação para se desenvolver novos procedimentos e novas abordagens utilizando-se tecnologia de ponta, de maneira a melhor se compreender e explorar os micro-organismos terrestres como fonte de compostos bioativos (Pearce et al., 2010). Micro-organismos de solo, particularmente actinomicetos, são excelentes produtores de produtos químicos bioativos estruturalmente únicos. Estes incluem antibióticos bacterianos e fúngicos, agentes anticancerígenos, inibidores enzimáticos, imunossupressores, drogas hipocolesterolêmicas, inseticidas e agentes antiparasitários (Demain e Sanchez, 2009; Clardy et al., 2006; Singh et al., 2010 Genilloud et al., 2011).
Assim, é mais do que evidente que a maior parte do metabolismo secundário ainda é completamente desconhecida.
Referências
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